استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد
Summary
أساليب إيمونولابيلينج لتحليل السكان متميزة من microtubules في الدماغ الزرد يرد هنا، الذي قابلة للتطبيق على نطاق واسع للأنسجة الأخرى. ويحدد البروتوكول الأول أسلوب أمثل ل microtubules إيمونولابيلينج مستقرة ودينامية. البروتوكول الثاني يوفر طريقة للصورة، وتحديد مقدار microtubules الوليدة على وجه التحديد.
Abstract
Microtubules (MTs) هي الهياكل الحيوية والهشة التي تشكل تحديا للصورة في فيفو، لا سيما في أجنة الفقاريات. يرد وصف أساليب إيمونولابيلينج هنا لتحليل السكان مميزة للنظام التجاري المتعدد الأطراف في الأنبوب العصبي النامي الجنين الزرد. في حين يتم التركيز على الأنسجة العصبية، هذه المنهجية نطاق واسع ينطبق على الأنسجة الأخرى. الإجراءات هي الأمثل لأوائل إلى منتصف المرحلة سوميتوجينيسيس الأجنة (سوميتي 1 إلى 12 somites)، إلا أنها يمكن تكييفها وفقا لمجموعة من المراحل الأخرى مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة نسبيا. وينص البروتوكول الأول أسلوب لتقييم التوزيع المكاني للنظام التجاري المتعدد الأطراف مستقرة ودينامية، والقيام بتحليل كمي لهؤلاء السكان مع برامج معالجة الصور. ويكمل هذا النهج القائمة أدوات الصورة microtubule ديناميات والتوزيع في خطوط معدلة وراثيا في الوقت الحقيقي، باستخدام أو تعبير عابر من بنيات المعلمة. في الواقع، هذه الأدوات مفيدة للغاية، إلا أنها لا تميز بين سهولة بين دينامية واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. القدرة على الصورة وتحليل هؤلاء السكان microtubule متميزة آثار هامة لفهم الآليات الكامنة وراء استقطاب الخلية و morphogenesis. ويحدد البروتوكول الثاني تقنية لتحليل الوليدة النظام التجاري المتعدد الأطراف على وجه التحديد. ويتم ذلك بواسطة التقاط خصائص النمو حيثياته للنظام التجاري المتعدد الأطراف مع مرور الوقت، بعد ديبوليميريزيشن ميكروتوبولي مع نوكودازولي المخدرات وفترة انتعاش بعد تبييض المخدرات. هذا الأسلوب لم تطبق حتى الآن لدراسة النظام التجاري المتعدد الأطراف في الأجنة الزرد، ولكن مقايسة قيماً للتحقيق في الدالة في فيفو البروتينات المتورطين في الجمعية ميكروتوبولي.
Introduction
Microtubules (MTs) هي البوليمرات من α-وبيتا-tubulin أن تجميع إلى بروتوفيلامينتس الخطية، التي تجتمع لتشكل أنبوب أجوف1،2. النظام التجاري المتعدد الأطراف هي هياكل الاستقطاب، مع النمو السريع بالإضافة إلى الغايات وبطيئة النمو ناقص الغايات التي ترتكز سينتروسومي أو أخرى مركز (بعد) microtubule-تنظيم3. دي نوفو هو بدأها MT تشكيل نويات في الحلبة γ-tubulin المعقدة (γ-تورك)، الذي يوفر قالب ل الجمعية MT4. في أي خلية معينة، اثنين من السكان للنظام التجاري المتعدد الأطراف يمكن تمييز ذلك بدوره على مدى بمعدلات مختلفة. استكشاف MTs ديناميكية بيئتها الخلوية بالتبديل بين مراحل النمو والانكماش في عملية تعرف باسم الاستقرار الديناميكي5. خلافا لدينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، هي عدم تزايد استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف ونصف عمر أطول من الحيوي MTs6.
عقود من البحث في بيولوجيا الخلايا وقدم مجموعة متطورة من أدوات لدراسة هيكل النقل المتعدد الوسائط ووظيفة وأسفرت عن قدر كبير من المعرفة بشأن هذه العناصر سيتوسكيليتال. على سبيل المثال، النظام التجاري المتعدد الأطراف تلعب دوراً محوريا في إنشاء وصيانة الخلية القطبية، الذي يعزى إلى ليس فقط على قطبية الجوهرية، بل أيضا إلى توزيع سوبسيلولار التفضيلية مستقرة مقابل الديناميكي MTs7، 8-على النقيض من ذلك، الآن أقل من المفهوم حول هندسة النقل المتعدد الوسائط ووظيفة في بيئات (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد أكثر تعقيداً، مثل الجنين الفقارية، جزئيا بسبب التحدي المتمثل في التصوير سيتوسكيليتون طن متري بدقة عالية. وعلى الرغم من هذا القيد، خطوط الجيل الأخير بروتينات فلورية خضراء-الإعراب عن المحورة وراثيا أن تسمية النظام التجاري المتعدد الأطراف أو تعبير عابر لمعلم فلوريسسينتلي طن متري علامات زاد فهمنا للتغيرات الدينامية التي تخضع للنظام التجاري المتعدد الأطراف وعلى الخلوي و الدور التنموي في الجنين الزرد. شبكة النقل المتعدد الوسائط بالكامل يمكن تصويرها في خطوط معدلة وراثيا في tubulin الذي أما مباشرة البوليمرات9 أو tubulin مسماة غير مباشر المسماة البروتينات المرتبطة بالنقل المتعدد الوسائط باستخدام دوبليكورتين–مثل-كيناز (دكلك) أو انسكونسين (امتب)10، 11. خطوط أخرى (و بنيات) قد تم إنشاؤها أن التمكين من تقييم MT قطبية الأصيلة بوصفها على وجه التحديد مليون طن بالإضافة إلى نهايات أو ارتساء centrosome ناقص ينتهي11،،من1213، 14-قوة هذه الأدوات يكمن في القدرة على دراسة ديناميات طن متري في العيش، وضع الكائنات الحية. كشفت هذه الدراسات، على سبيل المثال، بالتوزيع المكاني والديناميكية للنظام التجاري المتعدد الأطراف في السكان خلية معينة، اتجاه الانقسامية spindles في الأنسجة التي تمر morphogenesis (مؤشر لطائرة انقسام الخلية)، الأقطاب البوليمر طن متري كما أنها تتصل بالعمليات مثل استطالة الخلية والهجرة، ومعدل نمو MT يحدده المذنب السرعة9،،من1315. الحد من هذه الأدوات أنها لا تميز سهولة بين مستقرة ودينامية السكان طن متري.
الرسم من الأدب بيولوجيا الخلية الغنية، أساليب إيمونولابيلينج صورة مستقرة ودينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف في الجنين الزرد يرد هنا، التي تعتبر مكملة لاستخدام خطوط محوره وراثيا. انتشار استخدام هذه الأساليب إيمونولابيلينج في الزرد قد أعاق نوعا ما الصعوبة في الحفاظ على سلامة النقل المتعدد الوسائط أثناء إجراء التثبيت. 1 بروتوكول يحدد أسلوب أمثل لمجموع إيمونولابيلينج، دينامية، واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف في عبور أبواب hindbrain الزرد النامي. وعلاوة على ذلك، أسلوب مباشر تجارياً باستخدام البرمجيات المتاحة هو وصف للتحديد الكمي لهؤلاء السكان طن متري. وتتميز عن دينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، استناداً إلى عدة تعديلات α-tubulin، مثل أسيتيليشن وديتيروسينيشن، التي تتراكم على استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف مع مرور الوقت16،17بوستترانسلاشونال استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. في الجنين الزرد، يحدث أسيتيليشن في الهدبية ومحواري النظام التجاري المتعدد الأطراف ولكن ليس في الطور البيني مستقرة MTs18، يحد من فائدة هذه العلامة إلى مجموعة فرعية من استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. وفي المقابل، يبدو ديتيروسينيشن تحدث في جميع MTs مستقرة في الجنين الزرد18. هذا التعديل بوستترانسلاشونال الكشف عن حمض الجلوتاميك محطة كاربوكسي α-توبولين (ديتيروسيناتيد توبولين)18 ، ويمكن الكشف عنها باستخدام مكافحة-غلو-tubulin19. على الرغم من أن ديتيروسينيشن يحدث تفضيلي على استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف، الأدلة التجريبية تشير إلى أن هذا التعديل بوستترانسلاشونال نتيجة، بدلاً من سببا ل الاستقرار MT16. ويتميز السكان MT متبادلة، وتتألف من دينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، استخدام جسم مضاد، مكافحة-تير-tubulin، الذي يعترف تحديداً بشكل تيروسيناتيد α-tubulin19. وبعد إيمونولابيلينج مع هذه العلامات وتصوير [كنفوكل]، يمكن إجراء التحليل الكمي للنظام التجاري المتعدد الأطراف (الطول والعدد والوفرة النسبية) في مناطق محددة من الأنبوب العصبي النامي. أسلوب مبسط يتم توفيرها هنا للقيام بهذا التحليل باستخدام برنامج معالجة الصور ثلاثية الأبعاد. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لمعالجة المسائل بخصوص morphogenesis وإنشاء أو نضوج الخلية القطبية20. وفي الواقع، ترافق وضع صفائف المستقطبة من استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف العديد من الأحداث التنموية، بما في ذلك مستقبله morphogenesis21، ابيثيلياليزيشن الخلايا في وضع الأنبوب العصبي18 واكسون تشكيل8.
ويصف 2 بروتوكول تكيف في فيفو مقايسة بيولوجيا الخلية لتحليل النظام التجاري المتعدد الأطراف من خلال هذه الجمعية المرحلة (نويات/مرسى والنمو)22،23. MTs الوليدة المنبسطة في سينتروسومي ويرتكز في وقت لاحق إلى الملاحق سوبديستال من مريكز الأم23. يتم وصف أسلوب لتحليل نمو MT الوليدة بعد ديبوليميريزيشن. يوفر هذا البروتوكول التفاصيل المتعلقة بمعاملة نوكودازولي ديبوليميريزي النظام التجاري المتعدد الأطراف والإجراءات تبييض المخدرات وفترة النقاهة بعد العلاج. ويرصد MT إعادة النمو على فترات زمنية منتظمةدا بوست تبييض قبل إيمونولابيلينج مع علامات لمجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف (مكافحة β-tubulin) جنبا إلى جنب مع علامات سينتروسومي (مكافحة γ-tubulin) ونواة (4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI))، ووفقا للإجراءات العامة المبينة في البروتوكول الأول. الخطوة ديبوليميريزيشن طن متري من هذا البروتوكول ضروري حيث أنه يمكن تقييم حيثياته MT النمو بدلاً من التمديد للنظام التجاري المتعدد الأطراف الموجودة مسبقاً. هذا الأسلوب لذلك يختلف عن الإجراءات الأخرى المنشورة لقياس معدلات النمو طن متري (في غياب ديبوليميريزيشن) باستخدام علامة زائد نصيحة مثل نهاية ملزمة البروتين 3 تنصهر فيها البروتينات الفلورية الخضراء (EB3-التجارة والنقل)، كما هو موضح في تران et al.، 11من عام 2012. وعلاوة على ذلك، هذا التحليل مفيد بشكل خاص لتحليل الأجنة المعيبة في الجمعية دي نوفو طن متري، مثل طفرات NEDD1 ذكر سابقا الذي تجنيد γ-tubulin سينتروسومي البصر، مما أدى إلى عدم اكتمال تشكيل الأنبوب العصبي والتشوهات العصبية24.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك حاليا العديد من الأساليب للتصوير ديناميات طن متري في وقت مبكر الزرد التنمية، بدءاً من تصوير مباشر من الجزيئات المعلمة إيمونولابيلينج من ثابتة الأنسجة11،12،،من1314. على الرغم من أن النظام التجاري المتعدد الأطراف في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المجهر [كنفوكل] تم شراؤها بأموال من الولايات المتحدة الوطني العلم مؤسسة (NSF)، منحة #DBI-0722569. وأيد البحث بالولايات المتحدة معاهد للصحة الوطنية المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس) منحة #GM085290 وإدارة الولايات المتحدة للدفاع (DOD) منحة #W81XWH-16-1-0466 الممنوح لجمهورية مقدونيا بروستر. أيد منحة الحيوية هاء إلى UMBC من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال كلية قبل وبرنامج تعليم العلوم الجامعية، ومنحة #52008090. وأيد براون ل. س من “الإدارة الأمريكية للتعليم جانن زمالة”، “زمالة الدراسات العليا ميييرهوف” الممولة من المنح المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس #GM055036، ومن أسيستانتشيب البحوث الممولة “وزارة الدفاع الأميركية” منحة #W81XWH-16-1-0466.
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
- Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
- Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
- Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
- Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
- Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
- Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
- Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
- Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
- Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
- Lee, S. -. J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
- Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
- Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 – Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
- Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
- Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
- Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
- Nam, S. -. C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
- Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
- Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
- Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
- Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
- FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010)
- . Z-functions – ImageJ Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017)
