Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı
Summary
Immunolabeling yöntemleri mikrotübüller gelişmekte olan Zebra balığı beyinde farklı nüfus analiz etmek için burada, genel olarak diğer dokulara geçerlidir açıklanmıştır. İlk protokol immunolabeling istikrarlı ve dinamik mikrotübüller için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi özetliyor. İkinci Protokolü görüntü ve doğmakta olan mikrotübüller özellikle ölçmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Mikrotübüller (MTs) görüntü vivo içindeözellikle de omurgalı embriyolar için zor olan dinamik ve kırılgan yapılardır. Immunolabeling yöntemleri burada MTs ayrı nüfus gelişmekte olan Nöral tüp Zebra balığı embriyo çözümlenecek açıklanır. Odağı sinir dokusu üzerinde olmakla birlikte, bu yöntem genel olarak diğer dokulara geçerlidir. Erken somitogenesis aşamalı orta embriyolar için (1 somite 12 somites için), ancak onlar nispeten küçük ayarlamalar ile diğer aşamalarında bir dizi için adapte edilebilir için yordamları optimize edilmiştir. İlk protokol istikrarlı ve dinamik MTs kayma dağılımını değerlendirmek ve görüntü işleme yazılımı ile bu nüfusun kantitatif analiz gerçekleştirmek için bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım görüntü Mikrotubul dynamics ve dağıtım gerçek zamanlı, kullanma transgenik çizgiler veya geçici ifade tagged yapıları, varolan araçları tamamlar. Gerçekten de, onlar kolayca dinamik ve istikrarlı MTs arasında ayrım yapmak ancak gibi araçlar çok yararlı olur. Görüntü ve bu farklı Mikrotubul nüfus analiz yeteneği hücre polarizasyon ve Morfogenetik temel anlayış mekanizmaları için önemli sonuçları vardır. İkinci Protokolü doğmakta olan MTs özel olarak çözümlemek için bir teknik özetliyor. Bu ilaç nocodazole ve ilaç Silinerek geçiş sonra bir iyileşme döneminde Mikrotubul bozulumu takip zaman içinde de novo büyüme özellikleri MTS çekimi ile gerçekleştirilir. Bu teknik henüz MTs çalışmada Zebra balığı embriyo uygulanmış olduğundan değil, ama vivo içinde işlev proteinlerin Mikrotubul derlemede karıştığı soruşturma için değerli bir tahlil olduğunu.
Introduction
Polimerler, α – ve β-birkaç hangi içi boş boru1,2oluşturmak üzere birleştirmek doğrusal protofilaments araya tübülin mikrotübüller (MTs) vardır. MTs biter hızla büyüyen ve yavaş-centrosome veya diğer Mikrotubul düzenleme Merkezi (MTOC)3bağlantılı biter eksi büyüyen polarize, yapılardır. De novo MT oluşumu, γ-tübülin yüzük karmaşık çekirdekleşme (γ-TURC), MT derleme4için bir şablon sağlayan tarafından başlatılır. Verilen herhangi bir hücresinde, MTS iki popülasyonun o dönüşü üzerinde farklı oranlarda ayrılır. Dinamik MTs büyüme aşamaları ve büzülme dinamik istikrarsızlık5olarak bilinen bir işlemle arasında geçiş yaparak onların hücresel ortamı keşfetmek. Dinamik MTs, aksine istikrarlı MTs sigara büyüyen ve dinamik MTs6‘ dan daha uzun bir yarı ömrü vardır.
Araştırmalar yılların MT yapısı ve fonksiyonu çalışma araçları karmaşık bir dizi sağlanan ve hücre iskeleti bu öğeler üzerinde bilgi büyük bir vücut sonuçlandı. Örneğin, MTs kurulması ve aynı zamanda kararlı dinamik MTs7, karşı farklı hücre altı dağıtım için kendi içsel polarite sadece atfedilebilecek hücre polarite bakım merkezi bir rol oynamaktadır 8. buna ek olarak, çok daha az MT mimarisi ve işlev omurgalı embriyo gibi daha karmaşık üç boyutlu (3-D) ortamlarında hakkında kısmen nedeniyle MT sitoiskeleti yüksek çözünürlükte görüntüleme meydan anlaşılmaktadır. Bu sınırlamaya rağmen GFP-ifade transgenik son nesil bu etiketle MTs hatları veya geçici ifade fluorescently öğesini MT işaretlerinin MTs geçmesi dinamik değişiklikleri ve onların hücresel anlayışımızı artmıştır ve Zebra balığı embriyo gelişimsel rolünde. Tüm MT ağ hangi tübülin transgenik satırlarında etiketli9 veya tübülin polimerler MT ilişkili proteinler kullanarak dolaylı olarak etiketlenir doğrudan olması yansıması Doublecortin-gibi-kinaz (Dclk) veya Ensconsin (EMTB)10, 11. Diğer çizgiler (ve yapıları) MT içsel polarite değerlendirilmesi özellikle MT artı biter etiketleme tarafından etkinleştirmeniz veya biter11,12,13, centrosome bağlantılı oluşturulan 14. organizmalar geliştirme yeteneği MT dinamiklerini canlı, çalışma için bu araçları gücü yatıyor. Bu tür çalışmalar, örneğin, MTs kayma ve dinamik dağıtım, belirli hücre popülasyonlarının indirdik, Mitotik yönünü morfogenez (hücre bölünmesi boyutunda bir gösterge) geçiren dokularda MT polimer polarite spindles hücre uzama ve geçiş, gibi işlemleri ile ilişkisini ve MT büyüme hızı kuyruklu yıldız hız9,13,15tarafından belirlenir. Bu araçların onlar kolayca istikrarlı ve dinamik MT nüfus arasında ayırımcılık değil ki kısıtlamadır.
Zengin hücre biyolojisi edebiyatından çizim, Zebra balığı embriyo istikrarlı ve dinamik MTs görüntüye immunolabeling yöntemleri burada, transgenik çizgiler kullanmak için tamamlayıcı olduğu açıklanmıştır. Zebra balığı böyle immunolabeling yöntemleri yaygın kullanımı biraz zorluk fiksasyon işlemi sırasında MT bütünlüğünün korunmasında engel olmuştur. İmmunolabeling toplam, dinamik, için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi protokol 1 özetliyor ve istikrarlı MTs gelişmekte olan Zebra balığı arka beyin bölümlerini çapraz. Ayrıca, ticari olarak kullanarak basit bir yöntem bu MT nüfus ölçmek için kullanılabilir yazılım açıklanmıştır. İstikrarlı MTs dinamik MTs α-tübülin, istikrarlı MTs saat16,17üzerinde birikir asetilasyon ve detyrosination, gibi çeşitli translasyonel modifikasyonlar dayalı dan ayırt edilirler. Zebra balığı embriyo asetilasyon silier ve aksonal MTs ama bu işaretleyici bir alt kümesi stabilize MTs ile kullanışlılığı sınırlama değil istikrarlı Interphase MTs18, oluşur. Buna ek olarak, Zebra balığı embriyo18tüm istikrarlı MTs oluştuğu detyrosination görünür. Bu translasyonel modifikasyon carboxy-terminal glutamik asit α-tübülin (detyrosinated tübülin)18 ortaya çıkaran ve anti-Glu-tübülin19kullanarak tespit edilebilir. Detyrosination tercihen istikrarlı MTs üzerinde oluşmakla birlikte, deneysel kanıtlar bu translasyonel modifikasyon bir nedeninin, MT istikrar16yerine bir sonucu olduğunu gösterir. Dinamik MTs oluşan karşılıklı MT nüfus bir antikor, anti-Tyr-bu özellikle α-tübülin19tyrosinated şeklinde tanır tübülin, kullanarak ayırt edilir. Bu işaretleri ve confocal görüntüleme immunolabeling gelişen Nöral tüp tanımlanan bölgelerde MTs (uzunluk, numarası ve göreli bereket) kantitatif analiz gerçekleştirilebilir. Akıcı bir yöntem 3 boyutlu görüntü işleme yazılımı kullanarak bu analiz gerçekleştirmek için buraya sağlanır. Bu yöntem morfogenez ve kuruluş veya hücre polarite20olgunlaşma ile ilgili soruları için uygulanabilir. Gerçekten de, istikrarlı MTs polarize dizileri hazırlama photoreceptor morfogenetik21, epithelialization gelişmekte olan Nöral tüp18 ve akson oluşumu8hücre de dahil olmak üzere birçok gelişimsel olay eşlik eder.
Protokolü 2 vivo uyarlaması MTs onların derleme aşaması (çekirdekleşme/çapalama ve büyümesi)22,23sırasında analiz etmek için bir hücre biyolojisi tahlil açıklar. Yeni doğmakta olan MTs parçalanmayabilir centrosome ve daha sonra anne centriole23subdistal uzantıları için bağlantılı. Yeni doğmakta olan MT büyütme bozulumu takip analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Bu iletişim kuralı, MTs, uyuşturucu Silinerek geçiş prosedürü ve tedavi sonrası iyileşme döneminde depolymerize için nocodazole tedavi için ayrıntıları sağlar. MT yeniden büyüme düzenli aralıklarla izlenirs yazı Silinerek geçiş işaretli toplam MTs için immunolabeling tarafından (anti β-tübülin) yanında centrosome için işaretleri (anti γ-tübülin) ve çekirdek (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), iletişim kuralı 1‘ de açıklanan genel yordamlara göre belirleme yapılacağı. MT bozulumu adım bu protokol değerlendirme de novo MT büyüme yerine önceden varolan MTs uzantısı sağlar, gerekli. Bu tekniği bu nedenle bağlayıcı protein 3 Tran ve ark.içinde gösterildiği gibi yeşil flüoresan protein (EB3-GFP), erimiş bağlıdır son gibi artı bir ipucu işaretleyici kullanarak (bozulumu yokluğunda) MT büyüme oranları ölçmek için yayımlanmış diğer yordamlar ayrıdır, 201211. Ayrıca, bu tahlil embriyo de novo MT derlemede arızalı analiz etmek için özellikle yararlıdır γ-tübülin centrosome için alımı Engelli daha önce bildirilen NEDD1 mutantlar gibi içinde eksik çıkan Nöral tüp oluşumu ve nöronal kusurları24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şu anda pek çok yöntem vardır MT dynamics erken Zebra balığı geliştirme görüntüleme için doku11,12,13,14sabit dan tagged moleküllerin canlı görüntüleme immunolabeling için değişen. Tek bir hücrede MTs dinamik ya da istikrarlı Devletleri’nde bulunabilir rağmen epithelialization içinde aşamalı olarak zaman içinde MTs bağları bir süreçtir. İstikrarlı ve dinamik MTs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Confocal mikroskop fonları ile ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF üzerinden), grant #DBI-0722569 satın alınmıştır. Araştırma tarafından ABD Ulusal kurumları, sağlık/Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (NIH/NIGMS) hibe #GM085290 ve ABD Savunma Bakanlığı (DOD) hibe #W81XWH-16-1-RM Brewster’a layık 0466 desteklenmiştir. E. Vital Howard Hughes tıp Enstitüsü öncesi üniversite ve lisans bilim eğitim programı aracılığıyla UMBC için bir hibe tarafından desteklenmiştir, #52008090 verin. S.P. Brown bir ABD bölümü, eğitim GAANN arkadaş grubu tarafından desteklenen, Meyerhoff Yüksek Lisans Bursu NIH/NIGMS grant tarafından finanse #GM055036 ve bir bilimsel araştırma ABD Savunma Bakanlığı hibe #W81XWH-16-1-0466 tarafından finanse edilen Asistanlığına Giriş.
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
- Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
- Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
- Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
- Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
- Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
- Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
- Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
- Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
- Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
- Lee, S. -. J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
- Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
- Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 – Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
- Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
- Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
- Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
- Nam, S. -. C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
- Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
- Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
- Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
- Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
- FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010)
- . Z-functions – ImageJ Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017)
