Icke-invasiv provtagning av slemhinna slemhinnan vätska för kvantifiering av In Vivo övre luftvägarna immun-medlare nivåer
Summary
Det här protokollet beskriver en icke-invasiv teknik för provtagning av ostörd slemhinna slemhinnan vätska från de övre luftvägarna. Det kan användas för att utföra kvantifiering av i vivo nivåer av proteinet mediatorer, såsom cytokiner och chemokiner, hos patienter i alla åldrar.
Abstract
Det här protokollet beskriver icke-invasiv provtagning av ostörd övre luftvägarna slemhinna slemhinnan vätska. Det också Detaljer den extraktionsmetod som används före analysen av immun medlare i vätska eluat för studien av luftvägarna aktuell immun signaturen, utan behov av stimulering förfaranden (används ofta av andra tekniker). Slemhinna slemhinnan vätskan samplas på en remsa av filtrerpapper placeras på den främre delen av underlägsen Concha och vänster för 2 min av absorption. Analyter elueras från filtrerpapper och de extraherade proteinbaserade eluat analyseras av en elektrokemiluminescens-baserad immunoassay, möjliggör hög känslighet kvantifiering av låg – och hög – nivå analyter i samma prov. Vi mätte i vivo nivåerna av 20 förvalda immun medlare relaterade till specifika immunförsvaret signalering utbildningsavsnitt i slemhinnan i övre luftvägarna, men tekniken är inte begränsad till specifika panel eller provtagningsplatsen. Tekniken genomfördes först i 7-åriga barn från Köpenhamn prospektiva studier på astma i barndomen2000 (COPSAC2000) kohorten med allergisk rinit. Det användes därefter i den längsgående COPSAC2010 födelsekohorten, provtas vid 1 månad, 2 år och 6 år och instanser av akuta respiratoriska symtom. Vi framgångsrikt erhållits och analyseras prover från 620 (89%) av 700 1-månad-gammal barn; några prover var under detektionsgränsen assay (redovisas som medianen (mellan kvartil rad (IQR)). Antalet prover under detektionsgränsen (dvs från 0 till börvärdet för de lägre detektionsgräns) för varje medlare var 29 (7,25-119,5). Denna teknik möjliggör kvantifiering av i vivo luftvägarna slemhinne immunsystemet profilen från födseln, kan tillämpas längdriktningen och kan tillämpas på studier om effekten av genetik och uppväxt miljöexponeringar, patofysiologi, endotyping och övervakning av sjukdomar i andningsorganen, samt utveckling och utvärdering av nya behandlingar.
Introduction
Slemhinna slemhinnan vätska i näsan gör upp den flytande delen av övre-luftvägarna systemet. Den består av en komplex matris av mediatorer som härrör från samspelet mellan epitelet och de immunceller som utgör den första försvarslinjen mot invaderande mikroorganismer. Nässlemhinnan är lättillgängligt, och det finns en stark funktionellt och immunologiskt relation mellan näsan och luftrören1. Kupén är av särskilt intresse i förhållande till luftvägssjukdomar som är vanliga i barndomen, såsom astma och allergisk rinit, men också en rad andra luftvägsproblem vanligare senare i livet.
Här, beskriver vi genomförandet av en metod för att provet ostört slemhinnor foder vätska från näshålan använder en filterpapper-baserad, icke-invasiv teknik, samt en efterföljande extraktionsförfarande, används för att eluera proteinbaserade analyter från filter papper före deras kvantifiering. Denna teknik kan exempelvis användas för att hämta i vivo immun signaturer av både friska individer och individer med olika luftvägssjukdomar. Dessutom är det möjligt att undersöka exponeringar av betydelse för en specifik immun signatur och utvärdera om det är en prediktor eller medlare av senare sjukdomsutvecklingen.
Slemhinna slemhinnan vätska har tidigare erhållits av nasal lavage2, som föregås ofta av en nasal utmaning test, där ett allergen introduceras i höga nivåer för att stimulera ett inflammatoriskt svar3,4. Dock nasal lavage tekniken är inte möjlig hos små barn och introducerar en okänd utspädningsfaktorn, vilket förvirrar utfallen som utspädd medlare nivåer kan falla under detektionsgränsen av assay5. Dessutom på grund av okända utspädningsfaktorn är uppmätta analyten svaren från de nasala utmaning testerna inte jämförbara mellan individer, vilket begränsar användbarheten av nasal lavage tekniken i en kohort inställning. Slutligen, allergen utmaning gäller endast hos sensibiliserade individer och andra utmaningar, såsom histamin utmaningen, är inte fysiologiskt relevanta, vilket kan orsaka en tak effekt på medlaren release. Dessa problem kringgås i presenteras filterpapper-baserade tekniken för slemhinna slemhinnan vätskeansamling, där enskilda utsöndringen av vätska och analyt nivåer är de enda faktorer som påverkar Inter-individuella varians.
Under förfarandet för utvinning elueras analyter från filtrerpapper efter tillsats av identiska volymer av buffert att alla prover. Detta gynnar liknande ex vivo -utspädning av alla prover. En extraktion buffert av albumin-baserade isotonisk saltlösning används för extraktion steg; Det möjliggör utvinning av proteinbaserade medlare och stabiliserar proteiner för att begränsa denaturering under påföljande frysning av eluerade proteiner före kvantifiering. För att undvika proteinnedbrytning under fasen extraktion, läggs en cocktail av proteashämmare till utvinning bufferten.
Genomförandet av tekniker som möjliggör kvantifiering av ostört, in-vivo-genererade immun medlare på slemhinnor platser är av yttersta vikt. Först, webbplatsen slemhinnor utgör den största immunologiska orgeln i kroppen. Andra, nasal platsen är den primära platsen för luftburen exponering och är ordentligt ansluten till respiratorisk immunologiska facket av lungorna1. Tredje, öppnar möjligheten att kartlägga detta viktiga organ med en icke-invasiv teknik möjlighet att tillhandahålla en uppsjö av information på den viktiga mikrob-immun interaktion axeln i förhållande till hälsa och sjukdom i luftvägarna. För det fjärde finns det många andra möjliga tillämpningar av denna teknik, till exempel studera lokala immunologiska förändringar i randomiserade, kontrollerade prövningar av läkemedel och mikronäringsämnen.
Vi genomfört initialt tekniken i Köpenhamn prospektiva studier på astma i barndomen2000 (COPSAC2000) kohorten, där vi bestämde immun profilen av slemhinna slemhinnan vätska i 7-åriga barn med allergisk rinit jämfört med friska kontroller13. Därefter, tillämpas vi framgångsrikt denna teknik på längsgående COPSAC2010 kohort och bedömda luftvägarna immun profiler på 1 månad, 2 år och 6 år och instanser av akuta respiratoriska symtom. Resultat från de 1-månad-gammal nyfödda har visat viktiga föreningar mellan immun signatur och uppväxt miljöexponering7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den teknik som presenteras här, kunde vi bestämma i vivo övre-luftvägarna slemhinnor immun profilen hos barn från så tidigt som 1 månad gammal, vilket inte har gjorts tidigare. Vi observerade att förekomsten av specifika luftvägarna bakterier och picornaviruses7,11, samt andra pre och perinatal exponeringar, var speglas i luftvägarna immun profilen för nyfödda. Dessutom använt vi dessa luftvägarna immun profildata för att studera verkn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrycker vår tacksamhet till barn och familjer av den COPSAC2010 kohortstudie för alla deras stöd och engagemang. Vi erkänner och uppskattar COPSAC forskargruppen och teknisk hjälp från tekniker Lisbeth Buus Rosholm, Danmarks tekniska universitet, för mätning av cytokiner och chemokiner unika insatser.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
