Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt in einem kleinen Volumen der recycelten Puffer und methodischen Aspekten der Aufnahme aktivitätsabhängige synaptische Plastizität in getauchten akute hippocampal Scheiben.
Abstract
Obwohl Experimente an Hirnschnitten seit 1951 im Einsatz gewesen, noch Probleme, die die Wahrscheinlichkeit, dass eine stabile und erfolgreiche Analyse der synaptischen Übertragung Modulation bei potenziellen oder intrazellulären Feldaufnahmen zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt methodische Aspekte, die bei der Verbesserung der experimenteller Bedingungen für die Aufrechterhaltung der akuten Hirnschnitten und zum Aufzeichnen von Feld exzitatorischen postsynaptischen Potenziale in einer handelsüblichen untertauchen Kammer hilfreich sein könnten mit einem Abfluss-Carbogenation. Die Abfluss-Carbogenation hilft, um den Sauerstoffgehalt in Experimenten zu stabilisieren, die verlassen sich auf das recycling von einem kleinen Puffer Reservoir zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der Droge Experimente. Darüber hinaus präsentiert das Manuskript repräsentative Experimente, die die Auswirkungen von verschiedenen Carbogenation-Modi und Stimulation Paradigmen auf die aktivitätsabhängige synaptische Plastizität der synaptischen Übertragung untersuchen.
Introduction
1951 wurden die ersten gemeldeten akuten Gehirn Slice Experimente durchgeführt1. 1971, nach erfolgreichen in-vitro- Aufnahmen von Piriform Rinde2,3 und die Entdeckung, dass hippocampale Neuronen quer entlang der Septotemporal Achse des Hippocampus4, eines miteinander der in-vitro- Ersteinspielungen von hippocampal neuronalen Aktivität erreicht5war. Die Ähnlichkeit der neurophysiologischen oder Neurostructural Parameter der Neuronen in Vivo und in Vitro Bedingungen sind noch Gegenstand der Debatte6, aber im Jahr 1975, Schwartzkroin7 darauf hingewiesen, dass die basale Eigenschaften der Neuronen werden in Vitro beibehalten und die Hochfrequenz-Stimulation (z.B. Tetanization) der Afferenzen in der hippocampal Bildung induziert eine lang anhaltende Erleichterung der synaptischen Potentiale8. Elektrophysiologische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität in Vitro stark erweitert die Studie der zellulären Mechanismen aktivitätsabhängige synaptische Plastizität9,10, 1973 von Bliss entdeckt worden war Et al. 11 in in Vivo Experimente mit Kaninchen.
Die Untersuchung von neuronaler Aktivität oder Signalwege in Gehirnscheiben und besonders in akuten hippocampal Scheiben, ist jetzt ein Standardwerkzeug. Jedoch schon überraschend, in-vitro- Experimente standardisiert werden, wie durch die mehrere Ansätze, die für die Erstellung und Pflege von akuten hippocampal Scheiben bestehen. Reid Et al. (1988) 12 überprüft die methodischen Herausforderungen für die Aufrechterhaltung der akuten Hirnschnitten in verschiedene Arten von Slice-Kammern und die Entscheidungen des Badens Medium, pH-Wert, Temperatur und Sauerstoff. Diese Parameter sind immer noch schwer zu kontrollieren in der Aufnahme Kammer durch die maßgefertigte Elemente der in-vitro- Slice-Aufnahme-Setups. Publikationen finden Sie, dass einige methodischen Herausforderungen und das überwinden helfen, neue Arten von Überflutung Slice Kammern, z. B. eine interstitielle 3D Microperfusion System13, eine Kammer mit verstärkten Laminar-Flow und Sauerstoff beschreiben könnte liefern Sie14, ein System mit computergesteuerten Temperatur Kontrolle15und ein Mehrkammer-Aufnahme System16. Da diese Kammern nicht leicht zu bauen sind, verlassen sich die meisten Wissenschaftler auf handelsüblichen Slice Kammern. Diese Räume können auf einem Mikroskopsystem, so dass die Kombination der Elektrophysiologie und Fluoreszenz-imaging-17,18,19montiert werden. Da diese Kammern die Gehirnscheiben in künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) unter Wasser halten, muss eine hohe Durchflussrate der Pufferlösung beibehalten werden, erhöht die Kosten der Droge-Anwendung. Zu diesem Zweck haben wir ein Recyclingsystem Perfusion mit Abfluss-Carbogenation integriert, die genügend Stabilität für die Langzeitaufzeichnung von Feld-Potenziale in einer Überflutung Slice Kammer mit einem relativ kleinen ACFS Volume bereitstellt. Darüber hinaus zusammengefasst wir wie die Verwendung von diesem experimentellen Carbogenation/Perfusion System das Ergebnis der Tätigkeit-abhängige synaptische Plastizität10 auswirkt und wie Hemmung der eukaryotischen Dehnung Faktor-2 Kinase (eEF2K) moduliert synaptische Getriebe20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl Schnittstelle Slice Kammern robuster synaptische Antworten25,26,27,28aufweisen, bieten untertauchen Kammern zusätzlichen Komfort für die Patch-Clamp-Aufnahme und Fluoreszenz Imaging. So haben wir beschrieben, verschiedene Aspekte der möglichen Feldaufnahmen in akuten hippocampal Scheiben mit einer kommerziellen untertauchen Slice-Kammer, die leicht auf die Darstellung der Fluoreszenz …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W durchgeführt, analysiert, und die Experimente entworfen und schrieb das Manuskript. D.X. und C.P Abbildung Vorbereitung unterstützt und die Experimente durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt von NSFC (31320103906) und 111-Projekt (B16013), T.B.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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