少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録
Summary
このプロトコルでは、再生バッファーの量が少ないと水中急性海馬スライスにおける活性依存性シナプス可塑性を記録の方法論的側面の酸素レベルの安定化について説明します。
Abstract
脳スライスの実験は 1951 年以来使用されている、にもかかわらず、フィールドや潜在的な細胞内の録音を実行するとき、シナプス伝達の変調の安定した、成功した分析を達成するための確率を低減問題が残っています。この原稿は、急性脳スライスの維持のため、市販の水没商工会議所における興奮性シナプス後電位を記録するための実験条件の改善に役立つ可能性のある方法論的側面をについて説明します流出 carbogenation 付け。流出 carbogenation は、薬物実験のコスト効率を高めるために小さなバッファー貯留層の循環依存の実験で酸素レベルを安定させるのに役立ちます。さらに、原稿はシナプス伝達の活動依存的シナプス可塑性に及ぼす異なる carbogenation モードと刺激パラダイムを調べる代表的な実験を紹介します。
Introduction
1951 年に初めて報告した急性期脳スライス実験は実施1.梨状皮質2,3海馬ニューロンが海馬の4、1 つの septotemporal 軸に沿って横相互接続されて検出から成功体外録音後の 1971 年に、海馬神経活動の最初の in vitroの録音は達成5だった生体内および生体外での条件の下でニューロンの神経生理学的または neurostructural パラメーターの類似性はまだいくつかの討論の6件名が、1975 年に Schwartzkroin7ことが示された基底神経細胞の特性は体外で維持され、その高周波刺激 (すなわちtetanization) 海馬における求心性神経のシナプス電位8の長期的な円滑化を誘導します。記録神経活動の電気生理学的体外大幅拡大活動依存的シナプス可塑性9,10至福によって 1973 年に発見されていた細胞のメカニズムの研究ら11 生体内で実験ウサギ。
神経細胞の活動やシグナル伝達経路脳スライスで、特に急性海馬スライスの研究は今標準的なツールです。しかし、驚いたことに、体外実験があるまだ標準化される準備や急性海馬スライスのメンテナンスのために存在する複数のアプローチによっても明らかなようリードら(1988 年)12は、急性脳スライス スライス チャンバーの種類と入浴中、pH、温度、酸素のレベルの選択肢でのメンテナンスの方法論的課題を検討しました。これらのパラメーターは、まだスライス記録のセットアップの in vitroのカスタムメイドの要素のための記録室の制御が困難です。可能性があります問題の克服にいくつかの方法論的課題と説明水没スライス チェンバース、間質性の 3 D microperfusion システム13、強化された層流と酸素室などの新しいタイプの出版物を見つけることができます。14、コンピューター化された温度コントロール15システム、マルチチャンバ記録システム16を供給します。これらの部屋は簡単に構築できないので、ほとんどの科学者は市販のスライスの部屋に依存します。これらの部屋は、こうして電気生理学および蛍光イメージングの17,18,19の組み合わせを可能にする顕微鏡システムにマウントできます。以来、これらの部屋は、人工髄液 (アプライド) に沈んで脳スライスを維持、新薬承認申請の費用を増加緩衝液の流量を維持する必要があります。このため、流出 carbogenation 比較的小さいアプライド ボリュームを使用して浸漬スライス チャンバー内電位長時間記録の十分な安定性を提供するリサイクル灌流システムを組み込みました。さらに、我々 は活動依存的シナプス可塑性10の結果に影響を与えるこの実験的 carbogenation/灌流システムを使用し、どの真核伸長因子 2 キナーゼ (eEF2K) の抑制を調節するシナプスを要約伝送20。
Protocol
動物は、動物のケアの確立された標準と脳科学研究所と状態キー研究所の医療神経生物学の復旦大学、上海、中国の手順に従って維持されました。 1. ソリューションの準備 注: は、材料の表を参照してください。 (変更された Gey ソリューション) のスライスのバッファーを準備: 92 mM の NaCl、KCl、1.25 mM NaH2PO4、30 mM NaHCO3、2.5 mM 25 mM グル…
Representative Results
プロトコル セクションの男性 c57bl/6 マウスとラット (5-8 週間) の海馬 (図 1) の腹側と中間部分から急性海馬スライスの作製について述べる。スライサー プラットフォーム上半球の位置は、安定を保つのに役立ち、寒天やアガロースと安定化の必要性を削除します。灌流システム自体は液体の必要流量を与えるため高回転で作動、ペリスタルティ…
Discussion
インターフェイス スライス室より堅牢なシナプス応答25,26,27,28の展示物、水没室提供パッチ ・ クランプ記録および蛍光追加の利便性イメージング。したがって、我々 はフィールド ニューロン17,18、蛍光プローブのイメージングに簡単に拡張するこ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
大戦実施、分析し実験を設計し、原稿を書いていた。D.X. と C.P. 図の準備を支援し、実験を行なった。この作品は、NSFC (31320103906) によって支えられたおよび結核 111 プロジェクト (B16013)
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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Cite This Article
Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. J. Vis. Exp. (131), e55936, doi:10.3791/55936 (2018).