Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo
Summary
Este protocolo descreve a estabilização do nível de oxigênio em um pequeno volume de tampão reciclado e aspectos metodológicos da plasticidade sináptica dependente de atividade de gravação em fatias hippocampal agudas submersas.
Abstract
Apesar de experiências com fatias do cérebro têm sido utilizados desde 1951, subsistem problemas que reduzem a probabilidade de alcançar uma análise estável e bem sucedida da modulação da transmissão sináptica ao realizar gravações de campo potencial ou intracelular. Este manuscrito descreve aspectos metodológicos que podem ser úteis na melhoria das condições experimentais para a manutenção de fatias cerebral aguda e para gravação de potenciais pós-sinápticos excitatórios do campo em uma câmara de submersão comercialmente disponível com uma unidade de saída-carbogenation. O efluxo-carbogenation ajuda a estabilizar o nível de oxigênio em experimentos que contam com a reciclagem de um reservatório pequeno buffer para melhorar o custo-eficácia das experiências de drogas. Além disso, o manuscrito apresenta experimentos representativos que examinam os efeitos da estimulação paradigmas e modos diferentes de carbogenation sobre a plasticidade sináptica dependente da atividade de transmissão sináptica.
Introduction
Em 1951, os experimentos de fatia cerebral aguda primeiro-relatado foram realizados1. Em 1971, após a bem sucedida em vitro gravações da piriform córtex2,3 e a descoberta de que os neurônios hippocampal estão interligados transversalmente ao longo do eixo septotemporal do hipocampo4, dentre as primeiras gravações em vitro da atividade neuronal hippocampal foi alcançado5. A similaridade de parâmetros neurofisiológicos ou neurostructural de neurônios sob condições in vivo e in vitro são ainda objecto de algum debate6, mas em 1975, Schwartzkroin7 , indicou que o basal Propriedades dos neurônios são mantidas em vitro e que a estimulação de alta-frequência (ou seja, Tetanização) de afferents na formação hippocampal induz uma facilitação de longa duração dos potenciais sinápticos8. Eletrofisiológicos de gravação de atividade neuronal em vitro , expandiu o estudo dos mecanismos celulares de plasticidade sináptica dependente de atividade9,10, que havia sido descoberto em 1973 por Bliss et al. 11 no in vivo de experiências com coelhos.
O estudo da atividade neuronal ou sinalização de percursos em fatias do cérebro e especialmente em fatias hippocampal agudas, é agora uma ferramenta padrão. No entanto, surpreendentemente, experimentos em vitro ainda precisam ser padronizada, como evidenciado por várias abordagens que ainda existem para a preparação e manutenção de fatias hippocampal agudas. Reid et al . (1988) 12 revista os desafios metodológicos para a manutenção de fatias de cérebro aguda em diferentes tipos de câmaras de fatia e as escolhas de banhar o nível médio, pH, temperatura e oxigênio. Esses parâmetros são ainda difíceis de controlar na câmara devido aos elementos feitos sob medidas na vitro fatia-gravação configurações de gravação. Publicações podem ser encontradas que pode ajuda para superar alguns dos desafios metodológicos e que descrevem novos tipos de câmaras de fatia de submersão, tais como um sistema de microperfusion 3D intersticial13, uma câmara com maior fluxo laminar e oxigênio fornecer um sistema de gravação multi-câmara16, um sistema com controle de temperatura computadorizado15e14. Uma vez que estas câmaras não são fáceis de construir, a maioria dos cientistas dependem de câmaras fatia comercialmente disponível. Estas câmaras podem ser montadas em um sistema do microscópio, permitindo assim a combinação de eletrofisiologia e fluorescência de imagem17,18,19. Uma vez que estas câmaras mantém as fatias de cérebro submergidas no líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF), uma taxa de fluxo elevada da solução-tampão precisa ser mantida, aumentando a despesa da aplicação da droga. Para este fim, nós incorporamos um sistema de reciclagem da perfusão com vazão-carbogenation que fornece a estabilidade suficiente para a gravação de longo prazo dos potenciais de campo em uma câmara de fatia de submersão usando um volume relativamente pequeno aCSF. Além disso, estamos resumidos como o uso deste sistema experimental carbogenation/perfusão afeta o resultado de plasticidade sináptica dependente de atividade10 e como inibição da quinase de 2-fator de alongamento eucariótico (eEF2K) modula sináptica transmissão de20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de câmaras de fatia de interface apresentam mais robusta resposta sináptica25,26,,27,28, câmaras de submersão fornecem conveniência adicional para gravação de remendo-braçadeira e fluorescência imagem latente. Assim, descrevemos vários aspectos potenciais de gravações de campo em fatias hippocampal agudas utilizando uma câmara de fatia de submersão comercial que pode ser fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
W.W. conduzida, analisados e projetou os experimentos e escreveu o manuscrito. D.X. e C.P. auxiliou na preparação de figura e realizaram os experimentos. Este trabalho foi financiado pelo NSFC (31320103906) e 111 projeto (B16013) para tuberculose.
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
