تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة
Summary
ويصف هذا البروتوكول تحقيق الاستقرار في مستوى الأوكسجين في كمية صغيرة من المخزن المؤقت المعاد تدويرها والجوانب المنهجية لتسجيل تعتمد على النشاط اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد المغمورة.
Abstract
على الرغم من أن التجارب التي أجريت على شرائح المخ كانت تستخدم منذ عام 1951، ما زالت المشاكل التي تقلل من احتمال تحقيق تحليلاً مستقرة وناجحة للتحوير انتقال متشابك عند إجراء التسجيلات الميدانية المحتملة أو داخل الخلايا. هذه المخطوطة يصف الجوانب المنهجية التي قد تكون مفيدة في تحسين الظروف التجريبية للحفاظ على شرائح الدماغ الحادة وتسجيل إمكانات بوستسينابتيك ضادات الميدانية في دائرة غمر متاحة تجارياً مع وحدة كاربوجينيشن إلى الخارج. ويساعد التدفق–كاربوجينيشن لتحقيق الاستقرار في مستوى الأوكسجين في التجارب التي تعتمد على إعادة تدوير الخزان العازلة الصغيرة لتعزيز فعالية التكاليف التجارب المخدرات. وبالإضافة إلى ذلك، يعرض المخطوطة تجارب الممثل أن دراسة آثار أنماط كاربوجينيشن مختلفة ونماذج التحفيز على اللدونة متشابك تعتمد على نشاط انتقال متشابك.
Introduction
في عام 1951، كانت التجارب شريحة الدماغ الحادة التي ذكرت أول أجرى1. في عام 1971، بعد التسجيلات الناجحة في المختبر من الكمثرى قشرة2،3 واكتشاف أن الخلايا العصبية هيبوكامبال مترابطة العرض على طول المحور سيبتوتيمبورال الحصين4، واحدة من وكان أول التسجيلات في المختبر لنشاط الخلايا العصبية هيبوكامبال حققت5. التشابه بين المعلمات العصبية أو نيوروستروكتورال من الخلايا العصبية تحت ظروف فيفو في و في المختبر لا تزال موضوعا ل المناقشة بعض6، ولكن في عام 1975، أشارت شوارتزكروين7 القاعدية يتم الاحتفاظ بخصائص الخلايا العصبية في المختبر وأن التحفيز عالية التردد (أي، تيتانيزاتيون) من أفيرينتس في تشكيل هيبوكامبال الحث تيسير إمكانات متشابك8طويلة الأمد. الكهربية من تسجيل نشاط الخلايا العصبية في المختبر توسعا كبيرا في دراسة الآليات الخلوية المعتمدة على النشاط اللدونة متشابك9،10، التي اكتشفت في عام 1973 بالنعيم et al. 11 في فيفو التجارب مع الأرانب.
دراسة نشاط الخلايا العصبية أو إشارات المسارات في شرائح المخ، ولا سيما في الشرائح هيبوكامبال الحاد، الآن أداة قياسية. ولكن المثير للدهشة، تجارب في المختبر لم تكون موحدة، كما يدل على ذلك النهج المتعددة التي لا تزال قائمة لإعداد وصيانة لشرائح هيبوكامبال الحاد. ريد et al. (1988) 12 استعراض التحديات المنهجية للحفاظ على شرائح الدماغ الحادة في أنواع مختلفة من الدوائر شريحة والخيارات للاستحمام المستوى المتوسط والأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة والأكسجين. هذه المعلمات التي ما زال من الصعب التحكم في قاعة التسجيل بسبب عناصر مصنوعة خصيصا للأجهزة في المختبر تسجيل شريحة. منشورات يمكن العثور على أنه قد تساعد على التغلب على بعض التحديات المنهجية والتي تصف أنواع جديدة من غمر شريحة الدوائر، مثل نظام ميكروبيرفوسيون 3D فراغي13، دائرة مع تعزيز تدفق الصفحي والأكسجين العرض14، ونظام ب مراقبة درجة الحرارة المحوسبة15، و نظام تسجيل غرفة متعددة16. هذه الغرف ليست سهلة لبناء، تعتمد معظم العلماء على الدوائر شريحة المتاحة تجارياً. يمكن تحميل هذه الدوائر على نظام مجهر، مما يسمح للجمع بين الكهربية والأسفار التصوير18،،من1719. نظراً لهذه الدوائر تبقى شرائح المخ المغمورة في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام)، بمعدل تدفق عالية من المخزن المؤقت الحل تحتاج إلى صيانة، زيادة نفقات تطبيق المخدرات. وتحقيقا لهذه الغاية، ادخلنا نظام التروية إعادة تدوير مع تدفق–كاربوجينيشن الذي يوفر الاستقرار كافية لتسجيل الإمكانات الميدانية في دائرة غمر شريحة باستخدام وحدة تخزين صغيرة نسبيا قام طويلة الأجل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا تلخيص كيف يؤثر استخدام هذا النظام التجريبي كاربوجينيشن/التروية نتائج تعتمد على النشاط اللدونة متشابك10 وكيف ينظم متشابك تثبيط استطالة حقيقية النواة 2 عامل كيناز (eEF2K) 20من انتقال العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن واجهة شريحة الدوائر يحمل أكثر قوة الردود متشابك25،26،،من2728، غمر دوائر توفير راحة إضافية لتسجيل التصحيح-المشبك والأسفار التصوير. وهكذا، لقد قمنا بوصف عدة جوانب من التسجيلات الميدانية المحتملة في شرائح هي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
قد أجرى، وتحليلها، وتصميم التجارب وكتبت المخطوطة. مركزي وس. ب. وساعدت في إعداد الشكل وإجراء التجارب. هذا العمل كان يدعمها تشرف (31320103906) والمشروع 111 (B16013) على يد
Materials
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi，China | HH-1 | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, ‘synaptic tagging’, ‘late-associativity’ and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3′ UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
