Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central
Summary
Méthodes pour une livraison de gène à grande échelle du système nerveux central chez le rat sont couvertes. Dans cet exemple, le but consiste à mimer une maladie qui affecte l’ensemble de la moelle épinière. La transduction généralisée peut être utilisée pour fournir une protéine thérapeutique à la CNS d’une administration unique, périphérique.
Abstract
Vecteurs de virus adeno-associated virus (AAV) sont un réactif clé en neurosciences pour groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR), optogenetics, ciblant les cre-lox, etc.. Le but de ce manuscrit est d’aider le chercheur tente expansive du système nerveux central (CNS) transfert de gènes chez le rat par injection dans la veine queue d’AAV. Grande échelle expression s’applique pour les conditions avec une pathologie très répandue, et un modèle de rat est important en raison de sa grande taille et similarités physiologiques à l’homme par rapport à des souris. Dans cet exemple d’application, une transduction neuronale à grande échelle est utilisée pour simuler une maladie neurodégénérative qui affecte l’ensemble de la moelle épinière, sclérose latérale amyotrophique (SLA). La transduction de CNS grande échelle efficace permet également de livrer des facteurs protéiques thérapeutiques dans des études précliniques. Après un intervalle d’expression après l’injection de plusieurs semaines, les effets de la transduction sont évalués. Pour un vecteur de contrôle de la protéine fluorescente verte (GFP), la quantité de GFP dans le cervelet est estimée rapidement et sûrement par un programme d’imagerie de base. Pour les phénotypes maladie moteur qui sont induits par l’ALS concernant réponse transactive protéine protéine de liaison à l’ADN de 43 kDa (TDP-43), les déficits sont marqués par rotarod et réflexe de fuite. Au-delà de la modélisation de la maladie et la thérapie génique, il y a diverses applications potentielles pour le ciblage de gène de grande échelle décrite ici. L’utilisation accrue de cette méthode aidera à accélérer dans les neurosciences et la neurogénétique des tests d’hypothèses.
Introduction
Vecteurs recombinants adeno-associated virus (AAV) sont des outils indispensables pour la recherche de la CNS, parce qu’ils sont si efficaces pour la transduction des neurones in vivo. Des vecteurs d’AAV sont très versatiles pour étudier différents transgènes et isoformes protéiques, différents tissus, différentes espèces hôtes et les différentes voies d’administration. Par exemple, AAV peut être administré à des souris par un périphérique, peu intrusive, injection intraveineuse pour transmettre les neurones dans le système nerveux central comme le premier décrit dans Foust et coll. et Duque et al. (voir le document JOVE par Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 approche de prestation de ce gène est utilisée chez les rats d’exprimer efficacement une protéine fluorescente verte (GFP) ou l’ALS associés protéine, réponse transactive ADN-protéine de 43 kDa (TDP-43) dans le système nerveux central. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 travailler chez le rat est important car les paramètres physiologiques et métaboliques de la rat sont plus proches de l’homme par rapport aux souris et il y a des tests comportements et toxicologiques conçus spécifiquement pour les rats. En outre, les lignes de rat transgénique plus deviennent disponibles qui peuvent être utilisées dans les études de transfert de gène AAV.
Méthodes sont détaillées expansive CNS transfert de gènes chez le rat et la quantification rapide et fiable des résultats. Transduction de CNS à grande échelle est utilisée pour imiter la symptomatologie de la SLA chez les rats en exprimant TDP-43 tout au long de la moelle épinière. La méthode est des injections de veine de queue du vecteur TDP-43 à jeunes rats adultes que celui utilisé dans Jackson et al. 6 , 8 , 9 après plusieurs semaines, les déficits moteurs induite par TDP-43 sont marqués par deux méthodes : échapper à réflexe et rotarod tel qu’utilisé dans Dayton et al. et Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 pour le vecteur GFP contrôle, dans l’analyse post-mortem, la zone fluorescente du cervelet est calculée comme un indice d’efficacité de transduction utilisé dans Jackson et al. 6 , 8 l’analyse du cervelet s’est avéré pour être un index rapid et fiable du degré de transduction CNS après la livraison de gène périphériques et devrait s’appliquer à une variété d’approches tentative de transfert de gènes de centre-à-périphérique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une variété d’itinéraires de livraison ont été testés pour des vecteurs d’AAV : intra-parenchymateux, intra-cérébroventriculaire, intra-thécale, par voie intraveineuse, par voie nasale, intramusculaire, etc. Chaque itinéraire peut avoir des avantages spécifiques, mais aussi des inconvénients. Administration de queue veine de VAA à des rats adultes est une méthode fiable pour la réalisation de transduction cohérente du SNC. La méthode d’injection périphérique permet d’éviter l’introduction d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l’ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx et un don de charité pour la recherche ALS de Thomas Lawson, pour lesquels nous sommes reconnaissants. Nous remercions yassine verger et Donna Burney de conseils et de formation. JAS a été soutenu par la Fondation menti et accorder des National Institutes of Health GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
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