Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Summary

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l’intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un’amministrazione periferica, una tantum.

Abstract

Vettori di virus adeno-associato (AAV) sono un reagente chiave nelle neuroscienze per cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR), optogenetica, cre-lox targeting, ecc. Lo scopo di questo manoscritto è di aiutare l’investigatore tentativo di trasferimento del gene espansiva del sistema nervoso centrale (SNC) nel ratto tramite iniezione della vena della coda di AAV. Espressione su vasta scala è rilevante per le condizioni con patologia diffusa, e un modello del ratto è significativo a causa della sua maggiore dimensione e fisiologiche somiglianze agli esseri umani rispetto ai topi. In questa applicazione di esempio, una trasduzione neuronale su vasta scala è usato per simulare una malattia neurodegenerativa che colpisce l’intero midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (ALS). La trasduzione di CNS su vasta scala efficiente consente anche di fornire fattori di proteine terapeutiche in studi pre-clinici. Dopo un intervallo di espressione post-iniezione di parecchie settimane, vengono valutati gli effetti di trasduzione. Per un vettore di controllo della proteina fluorescente verde (GFP), l’importo di GFP nel cervelletto è stimato rapidamente e in modo affidabile da un programma di formazione immagine base. Per fenotipi di malattia motore che sono indotte da ALS relativi transactive risposta della proteina del DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43), i deficit sono segnati da rotarod e riflesso di fuga. Oltre alla modellazione di malattia e terapia genica, ci sono diverse applicazioni potenziali per la larga scala gene-targeting descritto qui. L’uso esteso di questo metodo sarà di aiuto nel velocizzare in neuroscienze e Neurogenetica di verifica delle ipotesi.

Introduction

Vettori ricombinanti virus adeno-associato (AAV) sono strumenti indispensabili per la ricerca di CNS perché sono così efficienti per trasdurre i neuroni in vivo. I vettori AAV sono molto versatili per studiare diversi transgeni e isoforme della proteina, diversi tessuti, ospitano diverse specie e diverse vie di somministrazione. Per esempio, AAV può essere somministrato a topi di una periferica, relativamente non-invasiva, l’iniezione endovenosa di trasdurre neuroni in tutto il sistema nervoso centrale come in primo luogo descritto in Foust et al e Duque et al. (vedere Giove carta da Gombash et al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} questo approccio di consegna del gene viene utilizzato nei ratti per esprimere in modo efficiente una proteina fluorescente verde (GFP) o l’ALS ha collegato la proteina, transactive risposta DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43) nel SNC. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} lavorando in ratti è significativo perché i parametri fisiologici e metabolici del ratto sono più vicini agli esseri umani rispetto ai topi e ci sono le analisi tossicologiche e comportamentali progettate specificamente per i ratti. Inoltre, altre linee di ratto transgenico stanno diventando disponibili che possono essere utilizzati in studi di trasferimento del gene AAV.

Metodi sono dettagliate per il trasferimento del gene CNS espansiva nel ratto e quantificazione rapida, affidabile dei risultati. Trasduzione CNS su vasta scala è usato per imitare la sintomatologia di ALS in ratti esprimendo TDP-43 in tutto il midollo spinale. Il metodo è coda vena iniezioni di TDP-43 vector per giovani ratti adulti come usato in Jackson et al. ^{6 , 8 , 9} dopo diverse settimane, i deficit del motore indotta da TDP-43 sono segnati con due metodi: fuga reflex e rotarod come usato in Dayton et al e Jackson et al. ^{5 , 6 , 7 , 9} per il vettore GFP di controllo, nelle analisi post-mortem, zona fluorescente del cervelletto è calcolata come un indice di efficienza di trasduzione come usato in Jackson et al. ^{6 , 8} l’analisi del cervelletto ha dimostrato di essere un indice rapido e affidabile del grado di trasduzione CNS dopo la consegna del gene periferico e dovrebbe essere applicabile a una varietà di approcci di tentare di trasferimento genico centro-periferico.

Protocol

tutte le procedure seguite le opportune linee guida NIH. Tutte le procedure di seguito protocolli degli animali che sono stati approvati dal comitato di utilizzo LSU Health Sciences Center a Shreveport e cura degli animali. Ratti Sprague-Dawley femminili a 6 settimane dell’età sono stati utilizzati per questa procedura. 1. determinare le dosi/volumi del vettore necessaria pesare i ratti per essere iniettato e determinare la quantità di vettore virale necessari per ogni animale ba…

Representative Results

TDP-43 motorie indotte dovrebbero sorgere entro 2-6 settimane a seconda della dose dell’AAV TDP-43 utilizzato (Figura 1). Iniezioni di vena infruttuoso coda si tradurrà in parziale o nessuna disabilità; l’AAV deve raggiungere il flusso sanguigno per produrre l’effetto. Un’iniezione di successo di AAV GFP si tradurrà nell’espressione di GFP in tutto il cervello e il midollo spinale in modo vettoriale-dose dipendente. Quando si utilizza il promotore ricombin…

Discussion

Una varietà di percorsi di consegna sono stati testati per i vettori di AAV: intra-parenchimali, intra-intracerebroventricolare, intra-tecale, endovenosa, intranasale, intra-muscolare, ecc. Ogni itinerario può avere vantaggi specifici, così come gli svantaggi. Amministrazione di coda vena di AAV ai ratti adulti è un metodo affidabile per la realizzazione coerente trasduzione dello SNC. Il metodo di iniezione periferica evita l’introduzione di una cannula di iniezione nei tessuti CNS e pertanto è come minimo dilagant…

Materials

Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss