Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Summary

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Abstract

Vetores de vírus adeno-associado (AAV) são um reagente chave nas Neurociências para cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR), optogenetics, cre-lox segmentação, etc. O objetivo deste manuscrito é ajudar o investigador a tentativa de transferência de genes de extenso sistema de nervoso central (SNC) em ratos através da injeção de veia de cauda de AAV. Expressão de larga escala é relevante para as condições com patologia generalizada, e um modelo do rato é significativo devido ao seu tamanho maior e fisiológicas semelhanças com os seres humanos em comparação com ratos. Neste aplicativo de exemplo, uma transdução neuronal em larga escala é usada para imitar uma doença neurodegenerativa que afeta toda medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica (ela). A transdução de CNS eficiente em grande escala também pode ser usada para entregar fatores de proteínas terapêuticas em estudos pré-clínicos. Após um intervalo de expressão pós-injeção de várias semanas, são avaliados os efeitos da transdução. Para um vetor de controle de proteína verde fluorescente (GFP), a quantidade de GFP no cerebelo é estimada rapidamente e confiantemente por um programa básico da imagem latente. Para fenótipos motor doença que são induzidos pelo ALS relacionados resposta transacional de proteínas DNA-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43), os défices são marcados por rotarod e reflexo de fuga. Além da modelagem de doença e terapia genética, existem diversas aplicações potenciais para o gene em larga escala como alvo descrito aqui. Expandido o uso deste método irá ajuda em acelerar testes nas neurociências e neurogenética de hipóteses.

Introduction

Vectores recombinantes vírus adeno-associado (AAV) são ferramentas indispensáveis para a investigação do CNS, porque eles são tão eficientes para transducing neurônios em vivo. Vetores AAV são muito versáteis para estudar diferentes transgenes e isoformas de proteínas, tecidos diferentes, espécies hospedeiras diferentes e diferentes vias de administração. Por exemplo, AAV pode ser administrado a ratos por um periférico, relativamente não-invasivo, injeção intravenosa para transduce neurônios em todo o CNS como o primeiro descrito em Foust et al e Duque et al (veja papel de Júpiter por Gombash et al (2014)). ^{1 , 2 , 3} abordagem de entrega este gene é usada em ratos eficientemente expressar qualquer proteína verde fluorescente (GFP) ou o ALS relacionados a proteína, a resposta transacional ADN-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43) no SNC. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} trabalhando em ratos é significativa porque o rato está fisiológica e metabólica parâmetros estão mais próximos aos seres humanos em comparação com ratos e há ensaios toxicológicos e comportamentais projetados especificamente para ratos. Além disso, mais linhas de ratos transgénicos estão se tornando disponíveis que podem ser utilizados em estudos de transferência de gene AAV.

Métodos são detalhados para transferência de genes de CNS expansiva no rato e rápida e confiável de quantificação dos resultados. Transdução de CNS em larga escala é usada para imitar a sintomatologia de ALS em ratos expressando TDP-43 ao longo da medula espinhal. O método é cauda veia injeções do vetor de ratos adultos jovens como usado em Jackson et al TDP-43 ^{6 , 8 , 9} depois de várias semanas, TDP-43-induzido motor défices são marcados por dois métodos: escapar de reflexo e rotarod como usado em Dayton et al e Jackson et al ^{5 , 6 , 7 , 9} para o vetor de controle GFP, em análise post-mortem, a área fluorescente do cerebelo é calculada como um índice de eficiência de transdução como usado em Jackson et al . ^{6 , 8} a análise do cerebelo tem provado para ser um índice rápido e confiável do grau de transdução CNS após a entrega do gene periférica e deve ser aplicável a uma variedade de abordagens, a tentativa de transferência de genes de periféricos-para-central.

Protocol

todos os procedimentos seguiram as orientações adequadas de NIH. Todos os procedimentos seguiram protocolos de animais que foram aprovados pelo Comitê de uso no centro de Ciências de saúde de LSU em Shreveport e cuidado Animal. Ratas Sprague-Dawley com 6 semanas de idade foram utilizadas para este procedimento. 1. determinar os doses/volumes de vetor necessário pesar ratos injetados e determinar a quantidade de vetor viral necessária para cada animal com base do título (con…

Representative Results

TDP-43 induzidas motor deficiências devem surgir dentro de 2-6 semanas, dependendo da dose da AAV TDP-43 usado (Figura 1). Injeções de veia de cauda malsucedida resultará em parcial ou sem deficiências; a AAV deve atinjam a corrente sanguínea para produzir o efeito. Uma injeção bem sucedida de AAV GFP resultará em expressão de GFP em todo o cérebro e a medula espinhal, de uma forma de vetor-dose dependente. Ao usar o promotor recombinante forte a e…

Discussion

Uma variedade de rotas de entrega foram testados para vetores AAV: intraparenquimatosa, intra-cerebroventricular, intra-thecal, por via venosa, intranasal, intramuscular, etc. Cada rota pode ter vantagens específicas, bem como inconvenientes. Administração de cauda veia de AAV de ratos adultos é um método confiável para a realização de transdução consistente do SNC. O método de injeção periférica evita a introdução de uma cânula de injeção nos tecidos CNS e, portanto, minimamente invasivo. A expressão…

Materials

Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss