שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית
Summary
שיטות משלוח הגן רחב היקף מערכת העצבים המרכזית בחולדה מכוסים. בדוגמה זו, המטרה היא לחקות מחלה המשפיעה על חוט השדרה כולו. התמרה חושית רחבה יכול לשמש כדי לספק חלבון טיפולית מערכת העצבים מהמינהל, היקפי חד פעמי.
Abstract
וקטורים Adeno-הקשורים וירוס (AAV) הם ריאגנט מפתח בהנורולוגיה עבור מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), optogenetics, מיקוד cre-סלומון, וכו ‘. מטרתו של כתב יד זה היא לסייע החוקר ניסיון ולקיבולת מערכת העצבים המרכזית (CNS) העברה גנטית בחולדה באמצעות הזרקת וריד הזנב AAV. רחב היקף הביטוי רלוונטי עבור תנאים עם פתולוגיה נפוצה, מודל עכברוש הוא משמעותי בשל גודל גדול שלה הדמיון הפיזיולוגיות לבני בהשוואה לעכברים. ביישום זה דוגמה, התמרה חושית עצביים בהיקף נרחב משמש כדי לחקות את מחלת ניוון עצבי המשפיעה על חוט השדרה כולו, נוירודגנרטיביות (ALS). התמרה היעילה של CNS רחב היקף חושית יכול לשמש גם כדי לספק חלבון טיפולית גורמים במחקרים קליניים. לאחר מרווח זמן פוסט-הזרקת ביטוי של מספר שבועות, השפעות התמרה חושית מוערכים. עבור וקטור שליטה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כמות ה-GFP ושההתפתחות מוערך במהירות ובאמינות על-ידי תוכנית ההדמיה הבסיסיים. עבור פנוטיפים מחלות מנוע זה הן תוצאה של ALS קשורים לתגובה טרנזקטיבי חלבון ה-DNA מחייב חלבון של 43 kDa (TDP-43), הגירעונות ציון על-ידי רפלקס הבריחה rotarod. מעבר מידול המחלה, טיפול גנטי, יש מגוון יישומים אפשריים עבור מיקוד רחב היקף ג’ין המתוארים כאן. השימוש המורחב של שיטה זו יסייעו לזירוז בדיקת מדעי המח, לנוירוגנטיקה השערות.
Introduction
וקטורים וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (AAV) הם כלי הכרחי לחקר מערכת העצבים המרכזית כי הם כל כך יעיל עבור transducing נוירונים ויוו. וקטורים AAV הם מאוד תכליתי לימוד שונים transgenes, חלבון איזופורמים ברקמות שונות, מארח שונים מינים, מסלולים שונים של ניהול. למשל, AAV יכול להיות מנוהל על מנת עכברים על ידי ציוד היקפי, יחסית לא פולשנית, לעירוי הזרקה כדי מגלי נוירונים לאורך מערכת העצבים ראשון המתוארים Foust. et al. , Duque. et al. (ראה יופיטר נייר על-ידי. Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 גישה מסירה זו ג’ין משמש בחולדות לבטא בצורה יעילה גם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או מכשיר הלייזר הקשורים חלבון, התגובה טרנזקטיבי DNA מחייב חלבון של 43 kDa (TDP-43) ב מערכת העצבים. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 עובדים אצל חולדות היא משמעותית כי הפרמטרים של החולדה הפיזיולוגיות וחילוף קרובים לבני לעומת עכברים ישנם מבחני רעילות ורגשיים שתוכננה במיוחד עבור חולדות. יתר על כן, יותר שורות עכברוש הטרנסגניים המשתפרת זה יכול להיות מנוצל AAV ג’ין העברת מחקרים.
שיטות מפורטים עבור העברה גנטית CNS מרחיבה את החולדה, מהיר, אמין כימות של התוצאות. התמרה חושית CNS רחב היקף משמש כדי לחקות את התנסותו של ALS בחולדות בהבעת TDP-43 לאורך חוט השדרה. השיטה היא זריקות וריד הזנב של וקטור TDP-43 חולדות למבוגרים צעירים כמו בשימוש. ג’קסון et al. 6 , 8 , 9 לאחר מספר שבועות, TDP-43-induced גירעונות מוטוריים הן שבוים על ידי שתי שיטות: לברוח רפלקס, rotarod משמש בין Dayton. ואח . ג’קסון et al. 5 , 6 , 7 , 9 עבור וקטור GFP שליטה, בניתוח שלאחר המוות, האזור פלורסנט של הצרבלום מחושב כמו אינדקס של התמרה חושית יעילות בשימוש ב. ג’קסון et al. 6 , 8 הניתוח של המוח הקטן הוכיחה להיות בעלת אינדקס מהיר ואמין של דרגת התמרה חושית CNS לאחר המסירה הגן היקפיים, צריך להיות ישים למגוון רחב של גישות ניסיון העברה גנטית ההיקפית אל מרכזי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מגוון רחב של מסלולים משלוח נבדקו עבור AAV וקטורים: אינטרה-parenchymal, אינטרה-cerebroventricular, thecal-“אינטרה”, תוך ורידי, תוך-אפי, התוך שרירי, וכד’. כל המסלול ייתכן יתרונות ספציפיים, כמו גם חסרונות. מינהל וריד זנב AAV חולדות למבוגרים היא שיטה אמינה להשגת התמרה חושית עקבית של מערכת העצבים. בשיטת הזרקת היקפיים מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי של ALS האגודה, הרפוי Karyopharm, inc., מאירה GTx, תרומה נדיבה למחקר ALS מ תומאס לאוסון, שעבורו אנחנו אסירי תודה. אנו מודים Elysse הפרדס, דונה ברני ייעוץ והדרכה. JAS נתמכה על ידי קרן שיקר ולהעניק מכוני הבריאות הלאומיים GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
- Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
- Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
- Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
- Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
- van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).
