Summary
Здесь мы описываем общий метод, чтобы вызвать хронические повреждения печени в мышах, кормления Дефицит холина и ethionine дополнены диеты (CDE). Мы демонстрируем, наблюдение за работоспособностью, печени перфузии, изоляции и сохранения. Время курса шесть недель может сообщить о повреждения печени, Патогистологический центр, фиброз, воспалительных и печени прогениторных клеток ответов.
Abstract
Хронические заболевания печени, таких как вирусный гепатит, алкогольная болезнь печени или Безалкогольные жирная болезнь печени, характеризуются постоянной воспаления, прогрессивного разрушения и регенерации печеночной паренхимы печени прогениторных клеток распространение и фиброза. Терминальная стадия все хронические заболевания печени-цирроз, основным фактором риска для развития гепатоцеллюлярной карциномы. Для изучения процессов, регулирующих начало болезни, создание и прогрессии, несколько животных модели используются в лабораториях. Здесь мы описываем шестинедельный курс холин недостаточным и дополнены ethionine (CDE) мыши модели, которая включает в себя питание шесть - неделя старый самцов мышей C57BL/6J холин недостаточным Чоу и 0,15% DL-ethionine дополнить питьевой водой. Мониторинг здоровья животных и Кривая потери веса типичный тела объясняются. Протокол демонстрирует брутто экспертизы CDE-лечение печени и крови коллекции сердца прокол для анализа последующих сыворотки. Далее печени перфузии технику и сбор различных печеночная лопастями для стандартных оценок являются оценки показали, в том числе печени гистология гематоксилином и эозином или Сириус красный stainings, immunofluorescent обнаружения печеночная клеточных популяций а также транскриптом профилирование печени микроокружения. Эта модель мыши подходит для изучения воспалительных, Фиброгенные и печени прогениторных клеток динамика индуцированных через хронические заболевания печени и может использоваться для проверки потенциальных терапевтических агентов, которые могут модулировать эти процессы.
Introduction
Печень является самым большим органом железистой метаболизм тела и имеет множество сложных функций. Ключевые роли для печени включают пищеварение, обмен веществ, детоксикации, хранения необходимых питательных веществ, производство компонентов белков плазмы крови и иммунитета, опосредованного через резидентов макрофаги или клеток Купфера. Печень имеет большую способность восстанавливаться, даже если до 70-90% его общей массы теряется. В случае острого повреждения печени такие, как видно после частичной гепатектомии или ацетаминофен отравления, оставшиеся здоровые гепатоцитов размножаться для ремонта повреждений в весьма скоординированного процесса1. Однако, когда гепатоцитов хронически травму из-за долгосрочной вирусной инфекции, алкогольные или Безалкогольные жирная болезнь печени, воспалительные микроокружения вызывает активацию клеток вождения фиброз печени севрюга и пролиферацию клеток печени Прародителя (LPC) способны дифференцироваться в cholangiocytes или гепатоцитов2,3,4,5. Точное происхождение, дифференциация судьба LPCs, их вклад регенерации печени и hepatocarcinogenesis были темы интенсивных дебатов и скорее зависят от тяжести травмы и контекст2. Порядок начала регенерации связанных событий также состязательно обсужена, с некоторые следователи, заявив, что активации севрюга печеночных клеток и ремонт матрицы имеет важное значение для поколения ЛСМ в пользу нишу6, тогда как другие отчет, что расширение ЛСМ и так называемые Ductular реакции необходимы для триггера fibrogenesis7. Существует множество животных моделей для изучения конкретных аспектов травмы и регенерации, в попытке понять основополагающие факторы, которые регулируют прогрессирования заболевания и в конечном итоге разработать новые стратегии лечения для пациентов8.
Холин недостаточным и дополнены ethionine (CDE) диетическое модель была первоначально разработана для использования в крыс и позднее изменено для индукции хронической травмы печени в мышах9,10. Диетический дефицит холина приводит к ослабленным Ассамблеи и секрецию липопротеиды очень низкой плотности. В сочетании с hepatocarcinogen DL-ethionine, этот режим приводит к чрезмерной печеночная жира загрузки, непрерывной воспаление, перипортальный фиброз, ЛСМ ответ и долгосрочные гепатоцеллюлярной карциномы развития11,12 . Однако, важно, разные мыши штаммов экспонат отличительных моделей воспалительных, Фиброгенные и ЛСМ ответ динамики13. Этот протокол описывает хронической травмы печени индукции мышей C57BL/6J, наиболее часто используемые инбредных мыши штамма.
В исследованиях хронической болезни печени типичный анализы включают гистологические оценки гематоксилином и эозином, а также Сириус красное окрашивание визуализировать коллаген осаждений, иммуногистохимических или immunofluorescent обнаружения печеночная клеточных популяций, и транскриптомики анализов печени микроокружения, который оркеструет индуцированных клеточных изменений через комплекс факторов роста и цитокинов сети14,,1516,17 , 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. животных экспериментов
всех животных исследования, описанные в этом расследовании были утверждены Комитетом по этике животных Куртинского университета (номер официального утверждения: AEC_2014_28) до начала эксперименты и осуществляется в соответствии с австралийским код для ухода и использования животных.
- Животных
- использовать для экспериментов шесть - неделя старый самцов мышей C57BL/6J.
- Экспериментальный дизайн
- после прибытия на объекте животных, позволяют мышей, чтобы акклиматизироваться за четыре дня до начала каких-либо экспериментов.
- Домовых мышей на пшеничные плевел постельные принадлежности, которые были истощены видимых зерна и стебли и держать мышей на 12-часовой день/ночь циклы в отдельности вентилируемые клетки. Смена постельного белья в дни три и семь, потом неделю после. Диета
- предоставляют мышей с ad libitum доступ к холин недостаточным и питьевой воды, дополнена 0,15% DL-ethionine. Держите DL-ethionine дополнить воды при температуре 4° C и заменить каждый второй день питьевой воды для обеспечения свежести и поощрения пить. Пополните дефицит холина Чоу каждый второй день с полным изменением Чоу один раз в неделю.
- Наблюдать мышей на отдыхе и во время обработки. Стандартные признаки здоровья животных, включая общее возникновение, осанки, социального взаимодействия, груминг, монитор пальто условие и вес тела.
- Взвешивание мышей ежедневно в течение первых двух недель эксперимента, чтобы убедиться, что любые животных, экспонируется более чем 20% тела потеря веса умерщвлены ограничить ненужные страдания. Обычно это случай в менее чем 5% животных. После двух недель, частота взвешивания может быть снижена в три раза в неделю (например, понедельник, среда, пятница).
- Печени перфузии и изоляции
- анестезировать мышей в точках указанного времени (в этом исследовании один, два, а шесть недель на диете CDE) с кетамин (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) внутрибрюшинной инъекцией. Проверить педаль вывода рефлекс для обеспечения адекватной анестезии.
- Мокрый мех с 70% этанола и сделать вертикальные срединной разрез в брюшной стенке до диафрагмы, ножницами Mayo. Грудная клетка могут быть удалены для облегчения доступа к сердцу.
- Собирать кровь медленно сердечной прокол, используя 25 G x 1/2 " регулярные стены иглой, чтобы избежать разрушения сердца. Позволяют крови к свертыванию в пробки microcentrifuge при комнатной температуре для получения образцов сыворотки после центрифугирования в 2000 g x 10 мин. Позже, измерять уровни трансаминаз сыворотки аланина, стандартные процедуры 12.
- Двигаться желудка и тонкой кишки в сторону и разоблачить воротной вены. Вырезать ножницами Mayo позволяет жидкости, чтобы выйти и perfuse печени с стерильных фосфата в буфер солевой сердца (рН = 7,4), cannulating воротной вены, с помощью 27 G x 1/2 " иглой регулярно стены. Равномерно бланшированные печень указывает успешное перфузии всех долей печени.
- Тщательно отсоединить печени и поместите его в чашку Петри, с помощью щипцов и Майо ножницы. Удаление ткани излишки, не печени и желчного пузыря.
- Сохранения печени
- после того, как был записан всего веса печени, одной небольшой доле несколько мелко нарезать несколько квадратных миллиметров, передавать их в стерильные пробирки и оснастки замораживание в жидком азоте для более поздних РНК и экстракции белка, согласно стандартных протоколов. Snap заморозить эти куски ткани как можно скорее после орган коллекции, чтобы избежать каких-либо деградации ткани.
- Собирать одной доле в нейтральных буферизации формалина 10% позднее обработки и встраивание парафин, как на стандартные протоколы.
- Место одной доле в форму заполненных с оптимальной резки температуры cryomatrix встраивание смолы и оснастки замораживание в жидком азоте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На протяжении шести недель время CDE-индуцированной хронической травмы печени параметры были оценены в дни 7 (фаза индукции), 14 и 21 (создание фаза) и 42 (фаза обслуживания). По сравнению с контролем мышей, мышей, CDE-лечение потеряли до 20% от их первоначального веса на этапе первоначальной адаптации и стремятся восстановить вес в установление и поддержание этапа (рис. 1). Вес тела обратно коррелировалось с уровни трансаминаз сыворотки аланина, показатель гепатоцеллюлярной травмы (рис. 2). Четыре тонкие микрометра, формалин исправлена и парафин врезанных тканей печени секции окрашивали гематоксилином и эозином оценить печеночная архитектуры. Здоровая печень отображается нормально архитектуры с упорядоченной шнуры гепатоцитов, идущих из центральной жилки, образуя паренхимы печени. В противоположность этому CDE-лечить печень показали значительно нарушен печени архитектуры и Паренхиматозный проникновения многих базофильная клеток в фазе индукции и создание и нормализации в фазы обслуживания (рис. 3). Чтобы оценить fibrogenesis, разделы 4-Микрометр тонкой, формалин исправлена и парафин врезанных печени окрашивали с поли Азо краска Сириус красный, который визуализирует печеночная коллаген осаждения. В фазе индукции CDE-индуцированной хронической травмы печени коллаген накопленных в паренхиме перипортальный регионов. Однако уровни нормализованы в создании и фазы обслуживания (рис. 4). Матрица встроенные и оснастки замороженные ткани печени был разрезать на тонкие разделы 7-микронной криостата. Immunofluorescent пятная для клеток маркеры затем была выполнена для анализа временных и пространственных расположение конкретных печеночная клеточных популяций во время курса. В здоровой печени желчных и печени прогениторных клеток маркер panCK только витражи желчных протоков структур, в то время как маркер воспалительных клеток CD45 обнаружено печени-резидентов макрофаги или клеток Купфера. В хронически потерпевшего печени однако, увеличение panCK окрашивание отражение пролиферации клеток печени и желчных прародителю, который достиг и достиг устойчивого состояния после около 14 дней лечения CDE. Количество воспалительных CD45-положительных клеток, представляющие печени резидентов и инфильтрирующие клетки, также достиг пика в фазе индукции CDE-индуцированного повреждения и постепенно нормализуется для контроля уровня в установление и поддержание фаз ( Рисунок 5). Это расширение воспалительных клеток населения в хронически потерпевшего печень сопровождали стремительные изменения в печени микроокружения. Было отмечено быстрое всасывание или значительное увеличение уровней транскрипции цитокинов и факторы роста. К ним относятся фактор некроза опухоли (ФНО), фактора некроза опухоли как слабый индуктором апоптоза (настройки), Лимфотоксин бета (LTβ), фактора роста гепатоцитов (HGF), превращая фактор роста бета (TGFβ) и интерлейкина-6 (IL-6), например. Их уровни Стенограмма все пика в фазе индукции и нормализуется на этапе создания и обслуживания - похож на ранее показанного болезни параметры (Рисунок 6).
Рисунок 1 . Тело вес записи здоровых и CDE-лечение мышей. Хронически потерпевшего мышей потеряли до 20% от их первоначального веса в фазе индукции CDE кормления и впоследствии восстановлены. Представитель диаграмма отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Сывороточные уровни трансаминаз аланина в здоровых и CDE-лечение мышей. (ALT) уровня трансаминаз в сыворотке аланина оставался неизменным в здоровых мышей во время 6 недельный курс, но пика в фазе индукции, с нормализации в стадии создания и поддержания в CDE-лечение животных. Представитель диаграмма отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Гематоксилин и эозина stainings печени секций. Формалин исправлена и парафин врезанных тканей печени секции, которые были окрашены с H & E продемонстрировал договоренностей об упорядоченном гепатоцитов шнуры управления мышей. В отличие от печени архитектура значительно был сорван в CDE-лечение мышей в фазе индукции, с нормализацией к концу время 6 недельный курс. Линейки шкалы представляет 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Сириус красного окрашивания способствует коллагена визуализация в здоровых и CDE-лечение мышей. По сравнению с контролем мышей, которые отображаются только незначительные perivenous коллагена осаждения, хронически раненых животных показали накопления коллагена в перипортальный паренхимы регионов в фазе индукции, с медленным нормализации к этапу эксплуатации и обслуживания по CDE курс шести недель. Линейки шкалы представляет 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Immunofluorescent обнаружение воспалительных и печени/желчных прогениторных клеток. В здоровую печень только желчных структуры окрашенных с panCK маркер клеток печени и желчных Прародителя (красный) и антитела CD45 визуализируется печень резидентов макрофаги или клеток Купфера (зеленый). В фазе индукции CDE, кормления, количество CD45+ клетки резко увеличилось, которая включала печени резидентов, а также инфильтрирующие воспалительных клеток. Это воспалительный процесс нормализации в конце tОн 6 недельный курс. Печени и желчных прародитель клеток что пятно с маркером panCK увеличение в количестве до недели и затем достиг устойчивого состояния. DAPI использовался для ядерных quantitation. Линейки шкалы представляет 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Транскриптомики анализ факторов роста и цитокинов. РНК был изолирован от оснастки замороженные куски CDE-лечение печени тканей для выполнения транскриптомики анализы печени микроокружения. Представитель диаграммы фактора некроза опухоли (ФНО), TNF-как слабый индуктором апоптоза (настройки), показаны Лимфотоксин бета (LTβ), фактора роста гепатоцитов (HGF), превращая фактор роста бета (TGFβ) и интерлейкина-6 (IL-6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хронические заболевания печени часто молчание болезни с большинства пациентов, будучи бессимптомно и это один из основных вкладчиков в заболеваемости и смертности во всем мире. Хронический алкоголизм и инфицирования вирусом гепатита являются ведущими причинами. Хроническое повреждение печени характеризуется воспаление печени, фиброза и в тяжелых случаях цирроз печени, рак и в конечном итоге печеночной недостаточности. В настоящее время нет никакого лечения, и хотя крупные успехи чтобы понять механизмы, заболевания печени, новые терапевтические возможности по-прежнему срочно требуются.
CDE диета является простой, время эффективным и легко применимой модели для индукции и изучения жирных изменения или печеночная стеатоз, воспаление, фиброз, ЛСМ распространения и в ходе долгосрочных экспериментов, развития гепатоцеллюлярной карциномы6 ,11,12,13,16,17. Первоначально используется в крыс19,20, позже она была адаптирована для облегчения исследования ЛСМ в wildtype и генетически измененных мышей9.
В нашей лаборатории мы нашли его важно использовать пшеничное плевел вместо других альтернатив, постельные принадлежности. Даже несмотря на то, что она истощается видимых зерна и стеблей, несколько дополнительных питательных веществ остаются в постельных принадлежностях пшеничная плевел и компенсировать некоторые из суровых последствий CDE-индуцированной хронической травмы печени индукции. Кроме того этот постельные принадлежности обеспечивает экологическая обогащению и призывает нормального питания поиска поведение у мышей. Подавляющее большинство неблагоприятных событий наблюдается в течение первой недели лечения CDE и редко видел впоследствии. Вероятность возникновения неблагоприятных событий может быть уменьшена с помощью мыши, которые имеют начальный вес по крайней мере 16 g. Однако если начальный вес более чем 18-20 г, количество Индуцированная печени прогениторных клеток могут быть ниже. В модели CDE может использоваться для изучения печеночная стеатоз, воспаление, печени прогениторных клеток ответов, фиброза и гепатоцеллюлярной карциномы развития без наличия цирроза печени, такие, как видно в некоторых безалкогольных жирная болезнь печени (NAFLD) и 21,больных, инфицированных вирусом гепатита B22. В сравнении модель thioacetamide (TAA) хронической травмы печени представляет более агрессивный режим. Это побуждает мягкой жирной изменения, воспаление, печени прогениторных клеток и фиброз, которое уже развивается в начале цирроз вокруг точки 6-недельный время12. Следовательно CDE кормления предлагается, если NAFLD связанные процессы исследования фокус, в то время как курс время TAA может быть выгодно, когда различные стадии фиброза тяжести представляют интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Существует ничего, чтобы быть раскрыты авторами.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана субсидии от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) Австралии (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Авторы хотели бы поблагодарить Кертин здравоохранения инновационной научно-исследовательский институт сотрудников для оказания технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
