नमूना तैयारी और Zebrafish से RNASeq आधारित जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण, लार्वा, या हल कोशिकाओं से पूरे transcriptome विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है । हम आरएनए के अलगाव, RNASeq डेटा के मार्ग विश्लेषण शामिल हैं, और qRT-पीसीआर-जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन आधारित है ।
Abstract
वैश्विक जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के विश्लेषण मनाया phenotypes अंतर्निहित उपंयास रास्ते की पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । zebrafish पूरे पशु या व्यक्तिगत सेल पशुओं की बड़ी संख्या से आरएनए के अलगाव की आसानी के कारण आबादी से पूरे transcriptome के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यहां आरएनए अनुक्रमण (RNASeq) का उपयोग कर zebrafish भ्रूण में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । हम पूरे भ्रूण से या सेल आबादी ट्रांसजेनिक पशुओं में छंटाई सेल का उपयोग प्राप्त से आरएनए की तैयारी का वर्णन । हम भी वैश्विक जीन अभिव्यक्ति डेटा सेट में समृद्ध रास्ते और जीन आंटलजी (GO) शब्दों की पहचान करने के लिए RNASeq डेटा के विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन । अंत में, हम मात्रात्मक रिवर्स transcriptase पीसीआर (qRT-पीसीआर) का उपयोग जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इन प्रोटोकॉल नियंत्रण और zebrafish के प्रयोगात्मक सेट के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उपंयास जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और ब्याज की phenotypes में आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।
Introduction
वैश्विक जीन अभिव्यक्ति के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपंयास को मनाया phenotypes योगदान जीन की पहचान उपकरण है । इस तरह के विश्लेषण आम तौर पर प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूनों के बीच की तुलना में प्रतिलिपि की मात्रात्मक मूल्यांकन पर निर्भर हैं । लक्षित दृष्टिकोण, जैसे qRT-पीसीआर अपेक्षाकृत तेजी से और सटीक एकल जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच के लिए कर रहे हैं । आरएनए अनुक्रमण (RNASeq) नमूनों के बीच जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक व्यापक, परिकल्पना मुक्त दृष्टिकोण प्रदान करता है, यह अब प्रयोगात्मक प्रणालियों में इस तरह की जांच के लिए मानक बना ।
Zebrafish कई रोग क्षेत्रों में एक प्रमुख मॉडल के रूप में उभरा है । मूलतः विकास जीव विज्ञान के अध्ययन में उनकी उपयोगिता के लिए विकसित की है, उनके उच्च fecundity और रखरखाव के अपेक्षाकृत कम लागत के कारण, zebrafish के प्रायोगिक उपयोग के लिए भ्रूण से phenotypes की एक व्यापक रेंज वयस्क चरणों के रूप में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है के रूप में अच्छी तरह से एक आणविक परख के वाइड सरणी1,2,3। दरअसल, इन फायदों आणविक यंत्रवत अध्ययन तेजी से और लागत प्रभावी सामग्री की बड़ी मात्रा में दोनों आनुवंशिक और पर्यावरण हेरफेर के जीवन के सभी चरणों में आसानी के साथ संयुक्त प्राप्त करने में आसानी की वजह से । इसके अलावा, zebrafish भ्रूण और लार्वा की पारदर्शी प्रकृति कोशिका पैदा करने और ऊतक-विशिष्ट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर असतत कोशिका आबादी4के vivo दृश्य में अनुमति देने के लिए आदर्श बनाते हैं । इस तरह की लाइनों के शोषण रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के आधार पर विशिष्ट पृथक कोशिका प्रकार में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण परमिट ।
यहां हम वैश्विक जीन अभिव्यक्ति zebrafish भ्रूण की संस्कृति के बाद RNASeq का उपयोग विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । आनुवंशिक प्रयोगात्मक जोड़तोड़, morpholino सहित (एमओ)-क्षणिक जीन पछाड़ना या CRISPR मध्यस्थता जीनोम संपादन आधारित है, कहीं प्रस्तुत किया गया है5,6,7. इसलिए हम पूरे भ्रूण से आरएनए के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करने या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं मार्ग उपकरण और जीन आंटलजी (जाओ) शर्तों का उपयोग कर RNASeq परिणामों के सरल गणनात्मक विश्लेषण द्वारा पीछा किया । अंत में, हम मात्रात्मक रिवर्स transcriptase पीसीआर (qRT-पीसीआर) द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन के लिए एक रणनीति शामिल है । इन प्रोटोकॉल zebrafish आनुवंशिक म्यूटेंट या पर्यावरणीय स्थितियों की तुलना सहित प्रयोगात्मक शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन भ्रूण के लिए लागू कर रहे हैं ।
Protocol
नीचे उल्लिखित सभी पशु प्रोटोकॉल के अनुसार और मैरीलैंड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।
1. भ्रूण वडा प्राकृतिक सहवास के माध्यम…
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण एक अपेक्षाकृत तेजी से और पूरे पशुओं या विशिष्ट हल कोशिका आबादी के transcriptome स्तर के विश्लेषण के लिए लागत प्रभावी रणनीति प्रदान करता है । zebrafish क्योंकि आसानी और शुरू करने की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), और T32DK098107 (T.L.H. और J.E.N.) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
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