Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish
Summary
Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.
Abstract
A análise das alterações de expressão do gene global é uma ferramenta valiosa para identificar novos caminhos subjacentes fenótipos observados. O peixe-zebra é um excelente modelo para avaliação rápida do transcriptoma toda de populações de células individuais ou todo animal devido à facilidade de isolamento do RNA de um grande número de animais. Aqui apresenta-se um protocolo para análise de expressão de gene global em embriões de peixe-zebra usando a sequenciação do ARN (RNASeq). Descrevemos a preparação do RNA de embriões de todo ou de populações de células obtidas usando célula de triagem em animais transgénicos. Também descrevemos uma abordagem para análise de dados RNASeq para identificar caminhos enriquecidos e termos de Gene Ontology (GO) em conjuntos de dados de expressão de gene global. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para a validação das alterações de expressão do gene usando transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Esses protocolos podem ser usados para análise comparativa de controle e experimental de moda de zebrafish para identificar alterações de expressão do gene de romance e fornecem a introspecção molecular de fenótipos de interesse.
Introduction
Análise comparativa da expressão gênica global é uma ferramenta valiosa para identificar novos genes, contribuindo para fenótipos observados. Tais análises normalmente contam com avaliação quantitativa da abundância de transcrição em comparação entre experimental e amostras de controlo. Abordagens específicas, tais como qRT-PCR são relativamente rápida e exata para investigação de alterações de expressão de gene único. A sequenciação do ARN (RNASeq) oferece uma abordagem ampla, livre de hipótese para identificar alterações significativas na expressão gênica entre as amostras, tornando-se agora o padrão para tais investigações através de sistemas experimentais.
Zebrafish têm emergido como um modelo de destaque em várias áreas da doença. Originalmente desenvolvido para sua utilidade em estudos de biologia do desenvolvimento, devido a sua alta fecundidade e relativamente baixo custo de manutenção, utilização experimental de zebrafish evoluiu para incluir uma ampla gama de fenótipos de embrionárias para estágios adultos, bem como um ampla gama de molecular ensaios1,2,3. Com efeito, estas vantagens fazem estudos moleculares mecanicistas rápida e econômica, devido à facilidade de adquirir grandes quantidades de material combinado com a facilidade de manipulação genética e ambiental em todas as fases da vida. Além disso, a natureza transparente de zebrafish embriões e larvas tornam ideal para a geração de linhas de transgénicos repórter células e tecidos específicos permitindo visualização na vivo de populações de células discretas4. Exploração de tais linhas permite a análise da expressão de gene global em tipos específicos de célula isolada baseados na expressão do gene repórter.
Aqui nós apresentamos um protocolo completo para análise de expressão do gene global usando o RNASeq após a cultura de embriões de peixe-zebra. Manipulações genéticas experimentais, incluindo Morpholinos (MO)-knockdown com base transitória do gene ou genoma mediada por CRISPR edição, foram apresentadas em outro lugar5,6,7. Nós, portanto, concentrar-se em um protocolo detalhado para isolamento de RNA de embriões todo ou classificados células transgénicas repórter-expressando seguidas por simples análise computacional de RNASeq resultados usando ferramentas de caminho e gene ontology (GO) termos. Finalmente, nós incluímos uma estratégia para a validação das alterações de expressão do gene por transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Estes protocolos são aplicáveis aos embriões de zebrafish, sujeitados a uma ampla gama de condições experimentais, incluindo comparação de mutantes genéticos ou condições ambientais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A abordagem descrita no presente protocolo oferece uma estratégia relativamente rápida e econômica para a análise do transcriptoma-nível de animais inteiros ou populações de célula específica classificada. O peixe-zebra fornece um modelo de vantajoso para este tipo de estudo devido a facilidade e a rapidez na geração de grandes quantidades de começar o material, a facilidade de aplicação genética ou ambientais condições experimentais e a disponibilidade de um grande espectro de linhas transgénicas repó…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
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