サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析
Summary
このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR による検証。
Abstract
グローバル遺伝子発現変動の解析は、観察された表現型の基になる新規経路を識別するための貴重なツールです。ゼブラフィッシュは動物の多数からの RNA の隔離のしやすさのため全体動物または個々 の細胞集団から全体のトランスクリプトームの迅速な評価の優れたモデルです。ここで RNA シーケンス (RNASeq) を用いたゼブラフィッシュ胚におけるグローバル遺伝子発現解析のためのプロトコルが表示されます。我々 は胚やトランスジェニック動物の細胞を用いての細胞集団から RNA の準備について説明します。濃縮経路と Gene Ontology (GO) 用語的遺伝子発現データセットを識別するために RNASeq データの解析のためのアプローチについて述べる。最後に、定量的逆転写 PCR (qRT PCR) を用いた遺伝子発現変動の検証のためのプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、新規遺伝子発現変動を識別するためにコントロールの比較分析およびゼブラフィッシュの実験セットを使用ことができ、興味の表現型への分子洞察力を提供します。
Introduction
遺伝子発現の比較分析、観察された表現型に貢献する新規の遺伝子を識別するために貴重なツールです。そのような分析は通常トラン スクリプトの豊富な比較実験の定量的評価に依存し、サンプルを制御します。QRT PCR など、ターゲットを絞ったアプローチが比較的迅速かつ単一遺伝子発現変動の調査のため正確です。RNA シーケンス (RNASeq) ことが今このような調査のための標準実験システム間でサンプル間の遺伝子発現の重要な変更を識別するために広い、無料の仮説のアプローチを提供しています。
ゼブラフィッシュは、多くの病気の分野で著名なモデルとして浮上しています。もともと彼らの高い多産と比較的低コスト、メンテナンスのための発生生物学研究でのユーティリティ ゼブラフィッシュの実験的使用として同様の大人の段階に胚から表現の広い範囲を含むように進化している、1,2,3の試金の分子の広い配列。確かに、これらの利点は、分子機構の研究は急速な人生のすべての段階で遺伝と環境両方の操作のしやすさと材料の大きい量を獲得しやすいのためコスト効果の高い結合します。さらに、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の透過的な性質作る離散セル人口4の生体内可視化を許可する細胞と組織特異遺伝子改変レポーター行を生成するために理想的。このような行の搾取レポーター遺伝子発現に基づく特定の孤立セル型グローバル遺伝子発現解析が可能です。
ゼブラフィッシュ胚の培養後 RNASeq を使用して世界的な遺伝子発現解析のための包括的なプロトコルをご紹介します。Morpholino (MO) を含む遺伝子の実験操作-ベースの一過的遺伝子ノックダウンや CRISPR を介したゲノム編集、提示されている他5,6,7。したがって、全体の胚からの RNA の隔離のための詳しいプロトコルに焦点を当てるまたは経路ツールと遺伝子の ontology (GO) の用語を使用して RNASeq 結果の簡単な解析に続いてトランスジェニック レポーター発現細胞を並べ替えられます。最後に、我々 は定量的逆転写 PCR (qRT PCR) による遺伝子発現変動の検証のための戦略を含まれています。これらのプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の遺伝的変異体または環境条件の比較を含む、実験の条件の広い範囲を受けるに適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルで記述されているアプローチでは、全体の動物または特定のソートされた細胞集団のトランスクリプトーム レベル分析のため比較的迅速かつコスト効果の高い戦略を提供しています。ゼブラフィッシュのため使いやすさと出発物質、遺伝の実装の容易さや実験環境と大規模な可用性の大量の生成で、急速に研究のこのタイプの有利なモデルを提供します。細胞型の特定および…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、T32DK098107、P30DK072488 (N.A.Z.) R01DK102001 (N.A.Z.) によって支えられた (T.L.H. および J.E.N.)。
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
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