Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra
Summary
Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.
Abstract
El análisis de los cambios de expresión génica global es una herramienta valiosa para la identificación de nuevas vías subyacen fenotipos observados. El pez cebra es un excelente modelo para la evaluación rápida de transcriptoma conjunto de poblaciones de todo animal o individuales de la célula debido a la facilidad de aislamiento de ARN de grandes cantidades de animales. Aquí se presenta un protocolo para el análisis de expresión génica global en embriones de pez cebra, mediante secuenciación del RNA (RNASeq). Se describe la preparación del ARN de embriones enteros o de poblaciones celulares obtenidas mediante célula clasificación en animales transgénicos. También se describe un enfoque para el análisis de datos RNASeq identificar vías enriquecidas y términos de Ontology del Gene (vaya) en conjuntos de datos de expresión génica global. Por último, proporcionamos un protocolo para la validación de los cambios de expresión génica utilizando transcriptasa inversa cuantitativa PCR (qRT-PCR). Estos protocolos pueden utilizarse para el análisis comparativo de control y grupos experimentales del pez cebra para identificar cambios de expresión de gene nuevo y proporcionan la penetración molecular en fenotipos de interés.
Introduction
Análisis comparativo de expresión génica global es una herramienta valiosa para identificar nuevos genes que contribuyen a los fenotipos observados. Tales análisis normalmente dependen de evaluación cuantitativa de la abundancia de transcripción comparada entre experimentales y control de muestras. Enfoques específicos, tales como qRT-PCR son relativamente rápido y preciso para la investigación de los cambios de expresión de gen único. La secuencia de RNA (RNASeq) ofrece un enfoque amplio, libre de hipótesis para identificar cambios significativos en la expresión génica entre las muestras, lo que es ahora el estándar para tales investigaciones a través de sistemas experimentales.
Pez cebra han surgido como un modelo prominente en muchas áreas de la enfermedad. Originalmente desarrollado para su utilidad en estudios de Biología del desarrollo, debido a su alta fecundidad y relativamente bajo costo de mantenimiento, uso experimental del pez cebra ha evolucionado para incluir una amplia gama de fenotipos de embrionario a etapas adultas así como un amplia gama de molecular ensayos de1,2,3. De hecho, estas ventajas hacen estudios mecanísticos moleculares rápido y rentable debido a la facilidad de adquirir grandes cantidades de material combinado con la facilidad de manipulación genética y ambiental en todas las etapas de la vida. Por otra parte, la naturaleza transparente de larvas y embriones de pez cebra lo hacen ideal para la generación de células y tejidos específicos reportero transgénicos líneas visualización en vivo de células discretas las poblaciones4. Explotación de dichas líneas permite análisis de expresión génica global en tipos específicos de la célula aislados basados en la expresión del gen reportero.
Aquí presentamos un protocolo integral para análisis de expresión génica global usando RNASeq después de cultivo de embriones de pez cebra. Manipulación genética experimental, incluyendo morfolino (MO)-caída de base gen transitoria o la edición del genoma mediada por CRISPR, se presentan en otras partes5,6,7. Por lo tanto, centrarse en un protocolo detallado para el aislamiento del ARN de embriones enteros o clasificado transgénicas células expresando reportero seguidas por simple análisis computacional de resultados RNASeq utilizando herramientas de la vía y términos de gene ontology (GO). Por último, hemos incluido una estrategia para la validación de los cambios de expresión génica por PCR (qRT-PCR) de la transcriptasa inversa cuantitativa. Estos protocolos son aplicables a los embriones de pez cebra sujetados a una amplia gama de condiciones experimentales, incluyendo comparación de mutantes genéticos o las condiciones ambientales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque se describe en este protocolo ofrece una estrategia relativamente rápida y rentable para el análisis a nivel de transcriptoma de animales enteros o de poblaciones celulares específicas ordenadas. El pez cebra proporciona un modelo ventajoso para este tipo de estudio debido a la facilidad y rapidez en la generación de grandes cantidades de a partir de material, la facilidad de la aplicación de genética o ambientales condiciones experimentales y la disponibilidad de una gran espectro de líneas transgénic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) y T32DK098107 (T.L.H. y J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
