הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה
Summary
פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.
Abstract
הניתוח של שינויים בביטוי הגנים העולמי הוא כלי חשוב לזיהוי הרומן משעולים שבבסיס פנוטיפים שנצפו. דג זברה היא דוגמנית מעולה עבור הערכה מהירה של כל transcriptome של אוכלוסיות תאים כל בעלי חיים או בודדים בשל הקלות של בידוד של RNA ממספרים גדולים של בעלי חיים. כאן מוצג פרוטוקול לניתוח ביטוי הגנים העולמי ב עוברי דג זברה באמצעות רצפי RNA (RNASeq). אנו מתארים הכנה של RNA כל העוברים, או אוכלוסיות תאים תוך שימוש בתא מיון בבעלי חיים מהונדס. אנו מתארים גם גישה לניתוח של RNASeq נתונים ראשוניים לזיהוי מועשר מסלולים ותנאים ג’ין אונטולוגיה (קדימה) ערכות נתונים של ביטוי גנים גלובלית. לבסוף, אנו מספקים פרוטוקול אימות של ג’ין ביטוי שינויים באמצעות כמותיים רוורס טרנסקריפטאז PCR (לרביעיית-PCR). פרוטוקולים אלה יכול לשמש עבור ניתוח השוואתי של שליטה וקבוצות ניסיוני של דג זברה כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים הרומן, לספק תובנות פנוטיפים עניין מולקולרית.
Introduction
ניתוח השוואתי של ביטוי גנים העולמי הוא כלי חשוב לזיהוי גנים הרומן לתרום פנוטיפים שנצפו. ניתוחים כאלה בדרך כלל לסמוך על הערכה כמותית של שפע התעתיק בהשוואה בין ניסיוני ולשלוט דגימות. גישות יישוב, כגון לרביעיית-PCR הם יחסית מהיר ומדויק לחקירה של שינויים בביטוי גנטית יחיד. רצפי RNA (RNASeq) מציעה גישה רחבה, ללא השערות כדי לזהות שינויים משמעותיים בביטוי הגנים בין דגימות, שהופך אותו עכשיו התקן בחקירות אלה על-פני מערכות ניסויות.
דג זברה הופיעו כמודל בולטים על פני תחומים רבים של המחלה. פותח במקור עבור השירות שלהם בלימודי ביולוגיה התפתחותית, עקב שלהם פוריות גבוהה ועלות נמוכה יחסית של אחזקה, שימוש ניסיוני דג זברה התפתח לכלול מגוון רחב של פנוטיפים מ עובריים בשלבים למבוגרים כמו גם בתור מבחני מערך רחב של מולקולרית1,2,3. אכן, יתרונות אלה להפוך במחקרים מולקולריים מכניסטית מהירה, חסכונית בגלל הקלות של רכישת כמויות גדולות של חומר בשילוב עם הקלות של מניפולציה גנטית והן סביבתיים בכל שלבי החיים. יתר על כן, הטבע שקוף של דג זברה עוברי וזחלים להפוך אותו אידיאלי ליצירת קווים כתב מהונדס ספציפיים תאים או רקמות ומאפשר ויוו ויזואליזציה של אוכלוסיות תאים בדידים4. ניצול של קווים אלה מאפשר הכללית של הביטוי מפענוח סוגי תאים מבודדים ספציפיים המבוססים על ביטוי גנים כתב.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לניתוח ביטוי גנים גלובלית באמצעות RNASeq אחרי תרבות של דג זברה עוברי. שינויים גנטיים ניסיוני, כולל מורפולינו (מו)-מבוסס גנים ארעי או גנום בתיווך CRISPR עריכה, הוצגו במקומות אחרים5,6,7. אנו לכן להתמקד פרוטוקול מפורט עבור בידוד של RNA מעוברים כל או מיון הטרנסגניים תאים המבטאים כתב ואחריו ניתוח חישובית פשוטה של תוצאות RNASeq באמצעות שביל כלים ותנאי אונטולוגיה (קדימה) הגן. לבסוף, כללנו אסטרטגיה עבור אימות של שינויים בביטוי הגנים מאת כמותיים רוורס טרנסקריפטאז PCR (לרביעיית-PCR). פרוטוקולים אלה חלים דג זברה העוברים חשופים למגוון רחב של תנאי הניסוי, כולל השוואה של מוטציות גנטיות או תנאים סביבתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגישה המתוארת בעלון פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה יחסית מהירה וחסכונית עבור transcriptome ברמת ניתוח של כל בעלי חיים או אוכלוסיות תאים ממוינים מסוים. דג זברה מספק מודל יתרון עבור סוג זה של מחקר בשל נוחות במהירות על מנת לייצר כמויות גדולות של הפעלת חומר, להקל על יישום גנטי או תנאים סביבתיים ניסיוני, ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), T32DK098107 (T.L.H. ו- J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
