Eksempel forberedelse og analyse av RNASeq-baserte genuttrykk Data fra sebrafisk
Summary
Denne protokollen gir en tilnærming for hele transcriptome analyse fra sebrafisk embryo, larvene, eller sortert celler. Vi inkluderer isolering av RNA, sti analyse av RNASeq data, og qRT-PCR-baserte valideringen av genet uttrykk endringer.
Abstract
Analyse av globale gene expression endringer er et verdifullt verktøy for å identifisere romanen trasé underliggende observert fenotyper. Sebrafisk er en utmerket modell for rask vurdering av hele transcriptome fra hele dyr eller personlige celle populasjoner på grunn av brukervennlighet for isolering av RNA fra et stort antall dyr. Her vises en protokoll for globale gene expression analyse i sebrafisk embryoer ved hjelp av RNA sekvensering (RNASeq). Vi beskriver utarbeidelse av RNA fra hele embryo eller celle populasjoner får celle sortering i transgene dyr. Vi har også beskriver en tilnærming for analyse av RNASeq data å identifisere beriket veier og Gene ontologi (gå) vilkårene i globale gene expression datasett. Til slutt gir vi en protokoll for valideringen av genet uttrykk endringer ved hjelp av kvantitative revers transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokollene kan brukes for komparativ analyse av kontroll og eksperimentelle sett sebrafisk for å identifisere romanen gene expression endringer, og gi molekylær innsikt i fenotyper rundt.
Introduction
Komparativ analyse av globale genuttrykk er et verdifullt verktøy for å identifisere romanen gener bidra til observert fenotyper. Slike analyser er vanligvis avhengig av kvantitativ vurdering av transkripsjon overflod forhold mellom eksperimentelle og kontroll prøver. Målrettede tilnærminger, som qRT PCR er relativt rask og nøyaktig for undersøkelse av ett gen uttrykk endringer. RNA sekvensering (RNASeq) tilbyr en bred, hypotese-fri tilnærming for å identifisere viktige endringer i genuttrykk mellom prøvene, gjør det nå standarden for slike undersøkelser over eksperimentell systemer.
Sebrafisk har dukket opp som en fremtredende modell, over mange sykdom områder. Opprinnelig utviklet for deres nytte i utviklingsbiologi studier, på grunn av deres høy fruktbarhet og relativt lave kostnadene ved vedlikehold, eksperimentell bruk av sebrafisk har utviklet seg med et bredt spekter av fenotyper fra embryonale til voksen scener så vel som en bredt utvalg av molekylære søk1,2,3. Faktisk disse fordelene gjør molekylær mekanistisk studier rask og kostnadseffektivt på grunn av enkelt anskaffe store mengder materiale kombinert med brukervennlighet både genetiske og miljømessige manipulasjon i alle faser av livet. Videre gjennomsiktig natur sebrafisk befruktede egg og larver gjør det ideelt for å generere celle – og vev-spesifikk transgene reporter linjer slik at i vivo visualisering av diskrete celle populasjoner4. Utnyttelse av slike linjer tillater globale gene expression analyse i bestemte isolert celletyper basert på reporter genuttrykk.
Her presenterer vi en omfattende protokoll for globale genet uttrykk analyse med RNASeq etter kultur sebrafisk embryoer. Genetisk eksperimentelle manipulasjoner, inkludert morpholino (MO)-basert forbigående genet knockdown eller CRISPR-mediert genomet redigering har blitt presentert andre steder5,6,7. Vi har derfor fokusere på en detaljert protokoll for isolering av RNA fra hele embryo eller sortert transgene reporter-uttrykke celler etterfulgt av enkel beregningsorientert analyse av RNASeq resultater bruker veien verktøy og gene ontologi (gå) vilkårene. Endelig har vi inkludert en strategi for valideringen av genet uttrykk endringer av kvantitative revers transkriptase PCR (qRT-PCR). Disse protokollene gjelder for sebrafisk embryo utsatt for en rekke eksperimentelle forhold, inkludert sammenligning av genetisk mutanter eller miljøforhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen gir en relativt rask og kostnadseffektiv strategi for transcriptome-nivå analyse av hele dyr eller bestemte sorterte celle populasjoner. Sebrafisk gir en fordelaktig modell for denne typen studier letthet og hurtighet generere store mengder materiale, enkel implementering av genetiske eller miljømessige eksperimentelle forhold, og tilgjengeligheten av en stor spekteret av transgene reporter linjer slik at isolering av celle-type bestemt og vev-spesifikke populasjoner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) og T32DK098107 (T.L.H. og J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
