Summary
Denne protokol beskriver i detaljer generation af fodaftryk-fri induceret pluripotente stamceller (iPSCs) fra pancreas menneskeceller i feeder-fri betingelser, efterfulgt af redigering bruger CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins og karakterisering af den modificerede encellede kloner.
Abstract
Embryonale og inducerede pluripotente stamceller kan selv forny og differentiere sig til flere celletyper i kroppen. Pluripotente celler er således eftertragtede for forskning i regenerativ medicin og er i øjeblikket i kliniske forsøg for øjensygdomme, sukkersyge, hjertesygdomme og andre sygdomme. Potentiale til at differentiere sig til specialiserede celletyper kombineret med de seneste fremskridt i genom-redigering teknologier, herunder CRISPR/Cas-system har givet yderligere muligheder for at skræddersy genomet af iPSC for forskellige applikationer herunder sygdom modellering, genterapi, og påvirke overførselsveje differentiering, at nævne nogle få. Blandt de tilgængelige redigering teknologier fremstod CRISPR/Cas9 fra Streptococcus pyogenes som et værktøj til lokationsspecifikke redigering af de eukaryote genom. CRISPRs er let tilgængelige, billigt og yderst effektive i engineering målrettede redigeringer. Systemet kræver en Cas9 nukleasen og en guide sekvens (20-mer) specifikke for genomisk målet abutting 3-nukleotid "NGG" protospacer-tilstødende-motiv (PAM) rettet mod Cas9 til den ønskede genomisk locus, sammen med en universal Cas9 bindende tracer () RNA sammen kaldet enkelt guide RNA eller sgRNA). Her præsenterer vi en trinvis protokol for effektiv generation af feeder-uafhængig og fri for fodspor iPSC og beskrive metoder for genom-redigering af iPSC ved hjælp af Cas9 ribonucleoprotein (RNP) komplekser. Den genom-redigering protokol er effektive og kan være let multipleksede af pre-kompleksbindende sgRNAs for mere end ét mål med Cas9 protein og samtidig levere ind i cellerne. Endelig vil beskrive vi en forenklet metode til identifikation og karakterisering af iPSCs med ønskede redigeringer. Tilsammen, forventes de skitserede strategi at strømline generation og redigering af iPSC for mangfoldige programmer.
Introduction
Omprogrammering af humane somatiske celler til pluripotente tilstand af overekspression af omprogrammering faktorer har revolutioneret stamcelleforskning med programmer i sygdom modellering, regenerativ medicin og udvikling af lægemidler. Findes flere ikke-virale omprogrammering metoder til levering af omprogrammering faktorer og generere iPSCs, men processen er labor intensiv og ikke meget effektiv1. De virale metoder, er men effektiv, forbundet med problemer med virus integration og tumorigenisitetsforsøg2,3,4. I dette manuskript rapporterer vi brugen af cytoplasmatisk Sendai virus for at levere omprogrammering faktorer og fodaftryk-fri iPSC linjer, der mangler integration af enhver viral vektor sekvenser i deres genomer5. Sendai virus er et RNA-virus, der er fortyndet ud af cellen cytoplasma ~ 10 passager efter infektion og producerer omprogrammering faktorer i overflod, fører til hurtig og effektiv omprogrammering6,7. Den etablerede iPSCs kan derefter let skiftet til feeder-frit medium at undgå brugen af musen embryonale fibroblaster (MEFs) som feeder celler8.
I denne publikation, ud over skitserer Sendai virus medieret omprogrammering, beskriver vi også en forbedret protokol til redigering af iPSCs, som har potentialet til at levere ubegrænset menneskelige celler med ønskede genetiske modifikationer for forskning. Vi har brugt CRISPR/Cas9 teknologi til ændring af iPSCs, som nu bliver brugt til en bred vifte af applikationer, herunder knock-ins og knockouts, storstilet genomisk sletninger, poolede bibliotek screening for gen opdagelse, gensplejsning af talrige modelorganismer og gen terapi9,10,11. Denne teknik indebærer dannelsen af komplekser af Streptococcus pyogenes-afledte Cas9 nukleasen og 20-mer guide RNA'er, opnå mål anerkendelse via base-parring med genomisk target sekvens støder op til 3' nukleotid protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens. Cas9 nukleasen inducerer en dobbelt strandede pause ~ 3 nucleotider fra webstedet PAM, som efterfølgende repareret overvejende af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) vej fører til indrykninger eller sletninger i rammen åben læsning, og dermed funktionelle knockout af gener12.
Vores forbedrede protokol indeholder detaljer for kultur af human i bugspytkirtlen celler, deres omprogrammering på mitotically deaktiveret musen embryonale fibroblaster (MEFs) til at opnå højere effektivitet af omprogrammering, efterfølgende tilpasning til feeder-fri kultur på Matrigel, karakterisering af etablerede iPSCs, guidede CRISPR RNA design og forberedelse, levering til iPSCs som RNP komplekser, enkelt celle sortering for at generere klonede linjer af redigerede iPSCs, let screening og identifikation af redigeringer, og karakterisering af enkelt celle kloner. Genomisk sletninger blev effektivt genereret i denne undersøgelse af indførelsen af Cas9 protein og to CRISPR sgRNA RNP komplekser til at fremkalde dobbelt strandede pauser (DSBs) og sletning af de mellemliggende segment. Denne metode udnytter om brug af to guides generere sletninger i rammen åben læsning, høj effektivitet af NHEJ fører til lav række kloner at skal være kendetegnet og nem indledende screening af kloner af den automatiserede kapillær elektroforese enhed, fragment analyzer. Disse effektive genom-redigering metoder til at generere menneskelige stamceller-baseret sygdomsmodeller vil snart blive en standard og rutine fremgangsmåde i et laboratorium, stamceller. Endelig, præcise genom-redigering gør det muligt at gå ud over stamcelleforskning sygdom modellering og potentielt kunne hjælpe katalyserer celle-baserede behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. omprogrammering protokol
- Generation af menneskelige iPSC fra primære pancreas menneskeceller
- frakke en 6-godt plade med 1,5 mg/mL koldt kollagen og gør det muligt at gel ved 37 ° C i 1 h.
- Plade tidlige passage menneskelige primære pancreas celler i Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 celler) på en kollagen belagt 6-godt plade på dag -2 at opnå ca 2,5 × 10 5 celler eller mindst 60% confluency pr. godt på dagen for transduktion (dag 0). Den første undersøgelse, plade mindst 2-3 wells for at få et godt med ønskede confluency på dag 0. Brug mindst én godt som en kontrol til at tælle cellerne.
- På dagen for transduktion (dag 0), varme 1 mL af Prigrow III medium i et vandbad til hver brønd til at være transduced. Høste celler fra ét kontrolelement godt i 1 mL 10% FBS medium ved hjælp af 1 mL trypsin/EDTA i 5 min eller indtil cellerne afmontere for at udføre en celletal. For at få 10% FBS medium, tilføje DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvat og 1% ikke-essentielle aminosyrer.
- Tæller og kontrollere celler ved hjælp af tælleren celle levedygtighed og beregne volumen af hver virus, der er nødvendige for at nå målet baseret på celle nummer og virus titer. Brug mangfoldigheden af infektion (MOI) af KOS = 5, hc-Myc = 5 og hKlf4 = 3 for de i bugspytkirtlen celler.
- Tø ét sæt Sendai vektor rør i-80 ° C opbevaring på køl og forsigtigt tilføje de beregnede mængder af hver af de tre Sendai vektor rør til 1 mL af Prigrow III medium, pre varmet til 37 ° C. Pipette forsigtigt at blande opløsningen. Et godt i en 6-godt plade er nok for transducing med Sendai virale vektorer til at generere omprogrammerede celler.
- Opsug Prigrow III medium fra cellerne, og tilføje langsomt omprogrammering virus blandingen brønde med cellerne. Inkuber celler natten over i et 37 ° C kuvøse med en fugtig atmosfære med 5% CO 2.
- Forsigtigt skille sig af med virus blandingen på celler og erstatte med frisk Prigrow III medium den næste dag, 24 h efter transduktion. Kultur celler for 5 d og ændre mediet hver suppleant dag.
- På dag 5, forberede MEFs på 0,1% gelatine overfladebelagt 10 cm kultur retter (1,3 x 10 6 celler/parabol). Vokse MEFs i T175 kolber indtil dag 4 og derefter på dag 5, udsætte celler til 6.000 rads fra en kilde, γ-stråling før såning af celler 13 eller brug den kommercielle MEF kilde.
- På dag 6, brug 1 mL af celle detachement løsning i 10 min til at frigøre de transduced celler, plade dem alle på MEF retter i Prigrow III medium med rock inhibitor (5 mM materiel, 10 µM endelige) og inkuberes natten over i et 37 ° C kuvøse med en fugtig anvisnin re i 5% CO 2.
- Ændre Prigrow III medium til menneskelige stamceller medium den næste dag. For at gøre 500 mL af menneskelige stamceller medium, tilføje DMEM/F-12, 20% (v/v) knockout serum udskiftning (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamin; 100 µM uvæsentlige aminosyrer og 100 µM 2-mercaptoethanol. Ændre medium forsigtigt hver dag nu.
- Overholde plader regelmæssigt for fremkomsten af celle klumper eller kolonier vejledende omprogrammerede celler. De transformerede celler danner klonede aggregater med brostensbelagte morfologi og store kernen og nucleoli. Markere sandsynligt ' iPSC ' kolonier og tjekke dem regelmæssigt for vækst.
- Næsten fire uger efter transduktion som kolonier er klar til plukning eller overførsel, forberede 24-godt MEF plader af plating 1,3 x 10 6 celler/gelatine præ-coatede plade som før overførsel af enkelt kolonier.
- Forbered matrix membran (f.eks. Matrigel) af aliquoting det baseret på fortyndingsfaktoren på analysecertifikatet. Tilsættes en alikvot 25 mL DMEM/F-12 til pels fire 6-godt plader (1 mL/hul) og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i mindst 1 time før brug. Manuelt vælge 12-24 kolonier ved hjælp af en steril pipette-tip til Aspirér dem og overføre på MEF plader i 500 µL af menneskelige stamceller medium.
- Opsug medier i godt forsigtigt forstyrre eller bryde apart kolonierne. Også vælge 24-48 kolonier på matrix membran beklædt 24-godt plader. Membran overtrukne plader, brug mTeSR1 (suppleret med 10 µM rock hæmmer) i 24 timer og ændre hver dag. Inden for 6-10 d af picking kolonier, de er klar til at blive overført til de nye 24-godt og/eller 12-godt membran-plader for klonal ekspansion.
- Hvis det er nødvendigt, frigøre kolonier på MEFs ved hjælp af 1 mg/mL collagenase i 20 min., vaskes to gange med menneskelige stamceller/mTeSR1 og overførsel til membran belagt 12 - eller 24-godt plader. Hvis der er tilstrækkelig robust kolonier vokser på matrix membran fra trin 1.1.12, fryse kolonier på MEFs ved hjælp af iPSC frysning medier ifølge producenten ' s retningslinjer.
- Frigør robust kolonierne belagt på membranen i trin 1.1.12 bruger 500 µL af dispase i 20 min. og plade igen på matrix membran beklædt 12-godt plader. Manuelt skrabe off enhver differentierede celler eller kontaminerende MEF feeder celler vil berige for pluripotente kloner på membranen.
- Udvide klonerne efter 6-8 d ved dyrkning på membran beklædt plader af miljøomkostningerne med dispase løsning som før og plating småcellet aggregater på frisk membran beklædt 6 - eller 12-godt plade. Ændring mTeSR1 medium dagligt. Karakterisere de omprogrammerede kloner af alkalisk fosfatase farvning, immunfarvning for pluripotency markører (OCT3/4 og NANOG), FACS analyse af pluripotente celleoverflademarkører og differentiering assays. Vokse og kultur kloner på membran-belagte plader for alle assays herunder CRISPR redigering som forklaret ovenfor, medmindre anden belægning løsning er specifikt nævnt.
- Karakterisering af menneskelige iPSCs
- alkalisk fosfatase farvning
Bemærk: en kommerciel kit bruges her. Se tabellen materialer.- Plade formodede menneskelige iPSCs på 24-godt plade og kultur for 4-5 d med dagligt media ændring.
- At starte farvnings-protokollen, Aspirér næringssubstratet og cellerne vaskes med 1 mL af 1 x PBS med 0,05% Tween 20 (PBST).
- Tilsættes 0,5 mL fix i kit på cellerne og inkuberes ved RT for 2-5 min. aspirat løsningen og derefter vaske de faste celler med PBST. Lad ikke brøndene tørre.
- Tilsættes 0,5 mL af frisklavede AP substratopløsning pr. brønd ved at blande løsning A, B og C. Incubate celler i mørke (indpakket med folie eller i en mørk beholder) ved stuetemperatur for 5-15 min.
Bemærk: Nøje overvåge farveændringen og reaktionen standses, når farven forvandler lys til at undgå uspecifik farvning. - Reaktionen standses ved sugning AP substratopløsning og vask wells to gange med 2 mL 1 x PBS.
- Overholde kolonier under lup og tage billeder på 4 X eller 10 X forstørrelse ved hjælp af enhver lysfelt mikroskop med et kamera.
- Immunofarvning
- plade menneskelige iPSCs i 24-godt plade og kultur for 4-5 d med dagligt media ændring.
- Vaske cellerne en gang kort med PBS og fix i 20 min. med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
- Vaskes tre gange i 10 min (3 x, 10 min) med PBS på RT.
- Saturate ikke-specifikke websteder med 10% normalt ged eller æsel serum (NS, afhængigt af den animalsk sekundær antistof blev rejst i) i PBS for 40 min på RT. For kun intracellulære epitoper, omfatter 0,3% TX-100 i PBS (TX/PBS) til permeabilize.
- Vask 3 x 5 min. med PBS på RT.
- Fortyndes OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 og SOX17 antistofferne i en frisk løsning på 5% NS i PBS og inkuberes i 2 h i RT eller natten over ved 4 ° C.
- Vask 3 x for 5 min med PBS på RT.
- Fortyndes passende sekundære Alexa Fluor 488 eller 568 antistoffer i 5% NS/PBS og inkuberes celler i 1 time på RT.
- Vask 3 x i 5 min på RT.
- Inkuberes med DAPI i PBS i 10 min og vask 2 x til 5 min på RT. Brug en fluorescerende mikroskop til at tage billeder.
- Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)
- plade menneskelige iPSCs i en 6-godt plade og kultur till kolonierne bliver 80% sammenflydende (mindst 10 5 celler /sample) med daglige mTeSR1 medium forandring.
- På dagen for eksperimentet, isolere cellerne og tage afstand til en enkelt cellesuspension som forklaret ovenfor i protokollen. Vask med 10% FBS medium.
- For celleoverflademarkører, resuspend i 0,5-1 mL 10% FBS medium og holde på ice.
- For intracellulære markører, resuspend i 1 mL af 4% PFA/PBS og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur. Vask med 10% FBS medium. Resuspend i 0,1% TX/PBS og inkuberes i 15 min på is. Vask igen med 10% FBS medium. Resuspend i 0,5-1 mL 10% FBS medium og holde på ice.
- Tilsættes 50 µL af cellesuspension til 50 µL af 10% FBS medium indeholdende anbefalede mængde TRA-1-60, TRA-1-81 eller SSEA-4 antistoffer og Inkuber i 30 min. til 1 h.
- Vaskes to gange med 10% FBS.
- Resuspend i 100 µL af 10% FBS medium der indeholder fluorescerende sekundære antistoffer og Inkuber i 30 min. vaskes to gange med 10% FBS og resuspend i passende mængde på 10% FBS. Levende celler kan differentieres fra døde celler af propidium Iodid farvestof tilføjet på < 1 µg/mL til at anslå celle apoptose i løbet af processen.
- Tri-lineage differentiering
- frø to 6-godt plader med 1,5-2 x 10 6 iPSCs/brønd i mTeSR1 medium med 10 µM rock inhibitor.
- Tillader cellerne til at vokse for 2-3 d med dagligt mTeSR1 medium ændring indtil brøndene er 80-90% sammenflydende.
- For ectoderm induktion, tilføje neurale induktion medium (NIM) Ifølge producenten ' s instruktionerne i 2-3 brønde i 6-godt plader.
- Ændre mediet til RPMI indeholdende 2% B27 supplement minus insulin og 12 µM CHIR99021 for mesoderm induktion i 2-3 wells plader 14. Tilføj kun RPMI indeholdende 2% B27 supplement minus insulin for de næste 24 h. tilføje 5 µM IWP4 til RPMI mediet med 2% B27 supplere minus insulin i de næste 24 timer. Efter 72 h, erstatte medierne med RPMI indeholdende 2% B27 supplement fører til generation for at slå cardiomyocytes i 2-3 d.
- For endoderm induktion, ændre medium i wells af 6-godt plader til MCDB 131 suppleret med 1,5 g/L natriumbikarbonat, 1 x Glutamax, 10 mM glukose, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 og 5µM af CHIR99021 for 24 h. kultur i det samme medium uden CHIR99021 for 2-3 d 15.
- Følg immunfarvning protokol fra trin 2 for alle de tre slægter og tjekke for udtryk for relevante markører.
- alkalisk fosfatase farvning
2. Genom redigering af menneskelige iPSC ved hjælp af CRISPR-Cas9
- forberedelse af Cas9 protein og sgRNA
- alikvot Cas9 protein i microcentrifuge rør i sterile forhold og gemme delprøver af frysning rør på-80 ° C.
- Design to målretning guide RNA'er pr. gen baseret på software fra MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) eller enhver anden CRISPR guide design webtool. Målrette første eller anden exon af genet (baseret på åben behandling ramme) til at generere knockouts. Vælg de to guider, således at de skar tæt sammen (~ 30-100 bp apart) og vi kan nemt visualisere sletning ved hjælp af det samme sæt af screening primere. Vælg guider fra software output højere kvalitetsresultat og lavere antal off målwebsteder. Design screening primere ved hjælp af programmet primer blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Screening primere bør være mindst 100 bp fra Cas9 klippe websteder og PCR produktstørrelse skal helst være mellem 400-700 bp for lettere forstærkning ved PCR.
- Design to komplementære sgRNA oligo DNAs (19-22 nukleotider i længde afhængig af guide sekvens) med et Bsa1 skær site i hver ende. Oligo DNAs kan syntetiseres kommercielt og udglødet for at danne dobbelt-strenget DNA. Udglødning, tilføje 1 µL af 100 µM guider, 25 µL af udglødning buffer (10 mM Tris, pH7.5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) og 23 µL vand. Inkuber i et thermocycler er programmeret til at starte ved 95 ° C i 2 min. og derefter gradvis afkøling til 25 ° C over 45 min.
- Klon den 2 µL af resulterende fragment i en Bsa1 begrænsning enzym fordøjet 1 µL af in-house T7 promotor pCR2.1 vektor med en Cas9 bindingssted ved hjælp af T4 DNA ligase ifølge producenten ' s protokol.
- Sekvens de klonede DNA fragmenter og når troskab er etableret, in vitro- transskribere kloner ved hjælp af en T7 kit til at generere enkelt guide RNA'er. Rense sgRNAs med en kommerciel kit og elueres i RNase-fri vand. Kontrollere RNA-koncentrationen.
- Transfektion af hiPSCs
- kultur hiPSCs i mTeSR1 medium som beskrevet ovenfor indtil cellerne er 40-50% sammenflydende.
- To timer før nucleofection, Udskift mediet med 2 mL af forvarmet mTeSR1 medium indeholdende 10 µM rock inhibitor.
- En time senere, forberede destination brønde for nucleofected celler ved sugning membran, forberedt som ovenfor, fra 12-godt plade og erstatte med forvarmet 1 mL af mTeSR1 medium med 10 µM rock inhibitor. Holde ved 37 ° C i inkubation.
- Forbered nucleofection master mix (skala korrekt afhængigt af prøverne) for hver prøve af tilføje 16,4 µL af P3 primære celle supplement; 3,6 µL af supplere 1 fra nucleofector kit; 0,5 µg Cas9 protein og 0,5 µg for hver sgRNA i 22 µL pr. reaktion volumen. pMAX normal god landbrugspraksis vektor var også nucleofected som fabrikanten ' s henstillinger i celler nogenlunde vurdere effektiviteten af iPSC Transfektion.
- Vask hver godt med 2 mL RT PBS efter sugning medium indeholdende rock hæmmer fra iPSC brønde. Derefter Aspirér PBS, tilsættes 1 mL celle distance og inkuberes plade ved 37 ° C i 10 min.
- Resuspend celler i 3 mL af mTeSR1 medium og pipetteres forsigtigt op og ned for at generere en enkelt celle suspension. Overførsel dissocieres celler til en 15 mL centrifugeres rør indeholdende 5 mL mTeSR1 medium.
- Tælle celler med celle counter og samlede volumen kræves til 0,5 x 10 6 celler/Transfektion beregnes. Ønskede antal celler i 15 mL centrifugeglas, centrifugeres ved 200 x g i 5 min på RT og Opsug supernatanten.
- Resuspend hver enhed af 0,5 x 10 6 celler i 22 µL Transfektion master mix forberedt i trin 4. Hurtigt overføre celler i det centrale kammer i et godt af en nucleocuvette stribe. Læg strimlen i en nucleofector enhed og nucleofect celler ved hjælp af programmet CB150.
- Efter nucleofection, hurtigt tilsættes 80 µL forvarmet mTESR1 medium indeholdende 10 µM rock inhibitor til hvert hul i nucleofected celler. Forsigtigt mix af pipettering op og ned.
- Forsigtigt overføre celler fra strip til pladens huller membran præ-coatede 12-godt indeholdende mTeSR1 medium med rock hæmmer forberedt i trin 3.
- Efter 1 d, ændre til friske mTeSR1 medium uden rock inhibitor. Høst celler 2-3 d efter nucleofection til én celle sortering.
- Encellede Isolation af målrettede hiPSCs
- en dag før den sortering, forberede 96-brønd MEF plader ved såning 2 x 10 6 celler/gelatine-belagt plade i 10% FBS medium. Ca 70-80% af kloner overleve efter nucleofection og 2-3 MEF plader kan være forberedt for hver redigering eksperiment.
- Efter natten inkubation, ændre medium til menneskelige stamceller medium (som beskrevet tidligere) suppleret med 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (hæmmere tilføjet til medierne for at forbedre enkelt celle levedygtighed), og 5 mg/mL fibronektin at fremme vedhæftning.
- Erstatte medium på hiPSCs i 12-godt plade fra mTeSR1 til mTeSR1 mellem suppleret med 1 x SMC4 for mindst 2 h før enkelt celle sortering.
- Opsug medium fra hiPSCs og cellerne vaskes forsigtigt med PBS. Tilsættes 500 µL af celle detachement løsning i hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 10 min efter sugning PBS. Generere single-cellesuspension ved tilsætning af 1 mL af mTeSR1 (unsupplemented) til hver brønd og pipettering forsigtigt op og ned flere gange.
- Placer cellesuspension i en 15 mL konisk rør og centrifugeres i 5 min. ved 200 x g på RT. aspirat supernatanten og resuspend celler i 1 mL mTeSR1.
- Sortere cellerne i enkelte celler ved hjælp af en celle sorteringsanlæg med 100 mm dyse under sterile forhold med én celle i den enkelte godt af 96-brønd pladerne forberedt i trin 1.
- Fire dage efter sortering, koloni dannelsen skal være synlige; på dette tidspunkt erstatte næringssubstratet med menneskelige stamceller medium suppleret med 1 x SMC4.
- Otte dage efter sortering, erstatte medium med menneskelige stamceller medium og kultur for 2 d.
- Frigør kolonier ved hjælp af 1 mg/mL collagenase i 20 min. og overføre dem til 24-godt membran beklædt plader i mTeSR1 med rock inhibitor. Lad de encellede kloner vokse og uddrag deres genomisk DNA efter overlappe eller udvide dem. Bruge gen specifikke primere til at forstærke target-DNA ved PCR.
- Brug fragment analyzer kit til indledende screening af PCR forstærket target genomisk region af alle kloner ved at køre dem gennem gel/dye Bland ifølge producenten ' s instruktioner. Anslå den resulterende fragment størrelse i software PROSize ved at sammenligne det med passende stigen, som drives med prøverne. Sekvens den forventes ' redigeret ' kloner og analysere sequencing data til at bekræfte redigering eller sletninger.
- For sondringen mellem monoallelic og biallelic kloner, forstærke den redigerede sekvens med PCR og klon i pJET1.2 vektor. Sende mindst 8-10 kloner til sekvensering og kontrollere sekvens for at bekræfte redigering i én eller begge alleler.
- Når først med held målrettede iPSC kloner er blevet identificeret gennem genotypebestemmelse, undersøger for at bekræfte, at de ikke har mistet pluripotency eller fået kromosomafvigelser gennem processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne publikation, har vi fulgt en simpel men effektiv protokol for generation af iPSC fra pancreas celler ved hjælp af integration eller fodaftryk-fri Sendai virus vektorer. Figur 1A viser en skematisk gengivelse af denne omprogrammering protokol. De menneskelige pancreas celler blev købt kommercielt, kulturperler i Prigrow III medium og transduced med Sendai virus som forklaret ovenfor. Transduced spindel formet i bugspytkirtlen celler viste ikke nogen morfologiske ændringer for ~ 5 dage efter Sendai virus transduktion på dag 0, men derefter blive afrundet med større kerne og nucleoli. Nogle tidlige kolonier blev set efter en uge efter transduktion, men de var ikke samlet, som i vores erfaringer, disse kolonier hurtigt tage afstand og er som regel tidlige delvist omprogrammerede celler der ikke etablere robust kolonier. Ca 10-15 dage efter transduktion, små lyse kolonier blev observeret og blev plukket efter vækst (figur 1B, øverst til højre). Menneskelige iPSC kolonier er kompakt, tætpakket med tydelige kanter (betragtet som 'fuldt omprogrammerede celler') (figur 1B, dag 23 nederst i midten) og 'delvis omprogrammerede celler' er løs med huller i kolonien (figur 1B, dag 23 nederst til højre). Omprogrammerede pancreas celle kolonier var dyrkning på dag 18 (figur 1Bnederst til venstre) og var stor nok til at blive plukket manuelt af dag 23 (figur 1B, nederste midten). Kolonierne blev forgyldt på membran-belagte plader efter picking at få feeder-fri iPSC dag 30-40 (figur 2A, venstre). Nogle af disse 'robust' feeder-fri kolonier blev udvidet og kendetegnet for udtryk af alkalisk fosfatase, pluripotency og overflade markører i feeder-fri betingelser. Alle klonerne testet var positive for basisk fosfatase, da de viste lyse rødt efter assay (figur 2A, til højre). Pluripotency markører OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60 og TRA-1-81 blev også observeret til udtrykkes meget i alle kloner af immunfarvning eller FACS analyse (figur 2B og figur 3A).
Disse resultater viser, at de menneskelige iPSC kolonier genereret fra pancreas celler udtryk pluripotency markører i feeder-fri betingelser. Pluripotency blev også vurderet af styret differentiering af menneskelige iPSC til tre Kim lag: ectoderm, mesoderm og endoderm. Kloner på membran potent differentierede TUJ1-positive neuroner (ectoderm), NKX2-5-positive bankende cardiomyocytes (mesoderm) og SOX17-positive endodermal celler (figur 3B).
Efter grundig karakterisering, blev 3-robust, feeder-gratis iPSC klonede linjer valgt for den genom-redigering undersøgelser. De to guider med BsaI cut websteder på enderne blev designet for hvert gen til at klippe tæt sammen (dvs. n mindre end ~ 100 bp). Skematisk af protokollen er vist i figur 4. Denne sletning strategi anvendes til target gener gav os mulighed for at nemt slette en del af den første eller anden exon af et gen. Denne strategi var meget effektiv og vi kunne isolere redigerede kloner i hvert forsøg. Guiderne var klonet i BsaI fordøjet vektor og in vitro- transkriberet som beskrevet ovenfor. Vi nucleofected guider (RNA'er) og Cas9 protein som RNP komplekser til hurtig og effektiv redigering. Vi har også sorteret celler som enkelt celler på MEFs som nyttiggørelse af celler er højere i forhold til cellerne sorteret enkeltvis på membran-belagte plader. Genomisk DNA blev isoleret fra alle kloner, target del var forstærkes ved PCR og løst på fragment analyzer til at screene for ændringer i størrelser af target fragmenter i forhold til kontrolelementerne. Fragmentets størrelse sammenlignet med stigen køre med prøver at opdage «redigeret» kloner (figur 4, nederst). Det gjorde screening af kloner let som vi kunne gå > 90 kloner i én plade og resultater blev opnået med en nøjagtighed på ± 3 bp. De udvalgte kloner var derefter sekventeret for at bekræfte vildtype og muterede kloner. Vildtype kloner havde ingen sletning eller tilsætning af baser mens muterede kloner havde enten tilføjelse eller sletning i rækkefølge i forhold til vildtype. Klonerne viser overstregning eller tilføjelse i sekventering blev udvidet og klonede i pJET1.2 vektor til at identificere monoallelic og biallelic kloner af sekventering af mindst 8-10 kolonier pr. kloning. Monoallelic kloner havde baser slettet eller tilføjet i én allel og den anden var uændret og lignende til vildtype allel. Biallelic kloner havde sletninger i begge alleler. Omtrent blev tre hundrede kloner screenet for alle mål gener, som identificeret ca 9 monoallelic sletning kloner og 3 biallelic sletning kloner i hvert enkelt tilfælde. Dette svarer nogenlunde til en 3-fold reduktion i hyppigheden af generation af biallelic kloner sammenlignet med monoallelic kloner. Heterogenitet inden sletning amplikoner afspejles ufuldkomne og usammenhængende NHEJ reparation. Udtryk af genet blev sidst bekræftet ved udvinding af RNA fra målcellerne og udføre RT-PCR.
Figur 1: omprogrammering af pancreas menneskeceller til feeder-fri pluripotente celler (iPSC). (A) A skematisk protokol for generation af iPSC fra pancreas menneskeceller er vist. Pancreas celler dyrkes på kollagen-belagte plader og derefter overført til MEFs efter transduktion med menneskelige Sendai virus vektorer. De helt omprogrammeret kolonier blev derefter overført til menneskelige stamceller kvalificeret membran og karakteriseret. (B) Morphological ændres efter Sendai virus transduktion. Før transduktion Vis i bugspytkirtlen celler typisk spindel-lignende morfologi (øverst til venstre, dag 0). Små, tætte kolonier vises på MEFs af dag 12, der ligner menneskets pluripotente celle kolonier. Normalt de fuldt omprogrammeret menneskelige iPSC kolonier har meget klare grænser og kan afhentes i dag 23-30. En dissocierede koloni på dag 23 er vist på nederste højre. Alle billeder blev taget til fange på 100 X forstørrelse (10 X mål og 10 X okular). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: karakterisering af menneskelige iPSC. (A) A typiske fase kontrast billede af en iPSC koloni efter plukning og kultur i feeder-fri betingelser (40 X, 4 X mål og 10 X okular, venstre) efter Sendai virus omprogrammering af pancreas celler. Alkalisk fosfatase farves rød iPSC koloni er til højre. For basisk fosfatase farvning, iPSC kolonier var faste og farves rød efter tilsætning af substratopløsning ud fra sættet. Billederne blev taget til fange på 40 X. (B) immunfarvning for pluripotency markører NANOG, og OCT3/4 i feeder-fri menneskelige pancreas celle-afledte iPSCs. DAPI blev brugt til at plette kerne blå som kontrol. Alle billeder blev taget på 100 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm i alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: karakterisering af pluripotency og differentiering potentielle af iPSC. (A) FACS analyse af celleoverflademarkører SSEA4, TRA-1-60 og TRA-1-81 i feeder-gratis iPSCs. Cellerne var dissocieres til enkelt cellesuspension og farvet for celleoverflademarkører SSEA-4, TRA-1-60 og TRA-1-81. Den lilla top indeholder iPSC negativ (antistofkontrol) celler og pancreas iPSC kan visualiseres som den grønne top. (B) immunfluorescent billeddannelse af Kim lag markørgener. Udtryk markører TUJ1 ectoderm (grøn), NKX2-5 mesoderm (rød) og SOX17 endoderm (red) i celler efter styret differentiering af pancreas iPSC. Tilsvarende kontrol nukleare pletten DAPI er blå. Alle billeder blev taget på 100 X forstørrelse. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk af CRISPR/Cas9 sletning strategi. Et sgRNA par var designet (markant rød) med BsaI cut websteder i slutningen (vist som F og R) fortrinsvis rettet mod den første exon, udglødet, klonet i BsaI fordøjet modificerede vektor (pCR2.1, BsaI websted fremhævet grå), sekventeret og in vitro- oversat. De understregede sekvens af vektor viser den del slettet efter BsaI fordøjelse. Placeringen af screening primere er angivet med blåt. Cas9 og guide RNA'er var nucleofected i feeder-fri iPSC som en kompleks for genomisk sletninger. iPSCs var så enkelt celle sorteret på 96-brønd MEF plader, kulturperler, overført til membran, udvidet og screenet af fragment analyzer. For at køre prøverne på analysatoren, var genomisk DNAs af Cas9 og guide transfekteret kloner på membran udvundet og passeret gennem gel/dye-mix i analyzer til at vælge for potentielle «redigeret» kloner (nederst i midten). Relevante stigen markører, WT og potentielle redigerede kloner er markeret. Udtryk af genet blev bekræftet ved udvinding RNA og analysere med Q-PCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omprogrammering af humane somatiske celler til iPSCs har givet et stort løft til grundlæggende biologi forskning, personlig medicin, sygdom modellering, udvikling af lægemidler og regenerativ medicin16. Mange aktuelle og udbredte metoder til menneskelige iPSC generation kræver brug af virus med risiko for integration i vært genom eller episomal vektorer med lav omprogrammering effektivitet. Her præsenterer vi en effektiv metode til at generere feeder-gratis iPSCs fra pancreas menneskeceller med Sendai-virus, der fører til 'fodaftryk gratis' og effektiv omprogrammering. De deraf følgende menneskelige iPSCs er fri for viral transgener, vedligeholde pluripotency og undgå brug af ukendt eksogene faktorer. Generation af iPSCs i feeder-fri betingelser har lav omprogrammering effektivitet, så vi omprogrammerede de primære pancreas celler på feeder celler og derefter flyttede kolonierne til feeder-fri membran for ekspansion, kultur og karakterisering. Fusion af disse teknikker giver stabil, pålidelig og mere effektiv iPSC programmering.
Vi har også genereret iPSCs fra humane fibroblaster og andre primærelementer med denne metode, hvilket tyder på, at Sendai-virus kan bruges til at omprogrammere bred vifte af celler. Vigtige overvejelser er: behov for optimal confluency af primærelementer skal omprogrammeres som for få eller for mange celler virkninger omprogrammering effektivitet; en tidligere passage af primærelementer når cellerne stadig optimalt dividere; omhyggelig titrering af de virale vektorer, der resulterer i minimale celle apoptose og en høj effektivitet fører til nem afhentning af robust kolonier; kontrol af tabet af Sendai vektor transgen udtryk ved PCR på 10-15 passager til at sikre, at iPSCs 'fodaftryk gratis'; og strenge sterile forhold for kultur af iPSC på membranen.
Vi brugte en praktisk og effektiv metode til at CRISPR genom ændring for at redigere iPSC genom. Denne teknik kombinerer Cas9 protein og sgRNA, RNP komplekser til at genkende og Kløve de supplerende DNA-sekvenser. Det kan være let tilpasses til at målrette en genomisk sekvens ved blot at ændre den 20 bp guide RNA. Vores metode giver en let protokol for effektiv og reproducerbare redigering af menneskelig iPSCs, da de er mere arbejdskrævende, vanskeligt at transduce og dyre at vedligeholde end andre celler. Vi designe mindst to tilstødende men ikke-overlappende vejledninger for hvert mål gen, så et enkelt sæt af screening primere kan anvendes til screening af de redigerede kloner. Desuden genererer brug af to guider ~ 30-100 bp apart en stor sletning, som nemt kan visualiseres under indledende screening og sikrer, at nedbrydningen af protein. Guiderne kan testes i HEK-293 celler i første omgang at vurdere effektivitet før du starter analysen i iPSC. Desuden er det afgørende at fastsætte parametre for rutinemæssig Transfektion af reagenser til iPSC. Ved hjælp af pMAXGFP plasmid, Transfektion effektivitetsgevinster af > der rutinemæssigt opnås 80% og gen målretning/forstyrrelse effektivitetsgevinster af 3-10% i iPSCs. Den direkte levering af Cas9 RNP komplekser i cellerne i vores protokol giver hurtig handling og hurtig omsætning og opretholder høje priser af målrettet ændring. Vores tilgang beskæftiger enkelt celle sortering efter nucleofection af guider og Cas9 protein, at overvinde en betydelig hindring af genet målretning i blandet iPSC befolkningen og at sikre clonality af celler. Denne 'nye' overordnede fremgangsmåde er ligetil, let at multiplex, tager kun et par uger og kræver ikke nogen antibiotika udvælgelse. Vi ikke har overholdt tab i effektivitet ved fortløbende at indføre sletninger af CRISPRs i en cellelinie eller iPSCs, selv om karyotype analyse skal udføres i sådanne tilfælde at sikre genomisk stabilitet. Kloner skal også kontrolleres for udtryk pluripotency markører. Selv ikke et fokus i denne publikation, denne protokol kan være selvsupplering til at fremkalde nøjagtig genetisk modifikation af herunder reparation skabelon i Transfektion cocktail17,18.
Endelig, baseret på vores erfaringer, vigtige overvejelser for iPSC redigering protokol er: rationelt design af vejledninger til at minimere eller helt undgå off target mutationer især i regionen"frø" eller tæt på PAM motiv at blive ændret; optimering af nucleofection effektivitet i iPSCs at sikre levering af RNPs; kontrollere kvaliteten af rede guider; titrering af guide og Cas9 protein koncentrationer og validere deres aktivitet af in vitro biokemiske kavalergang-undersøgelser eller som beskrevet i denne artikel i menneskelige cellssuch som HEK celler der er lettere at kultur og transfect; Brug af tidlige passage iPSCs, der er i log fase af vækst og nå ~ 50% confluency; omhyggelig håndtering af celler med blid medium ændres efter enkelt celle sortering for at sikre overlevelse af celler.
Vi mener, at den ovenfor skitserede protokol afgrænset i tilstrækkelig detaljeret vil udstyre læsere med en køreplan for oprettelse og redigering iPSC på en reproducerbar måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BT er en stiftende medlem af renovere Biosciences Inc.
Acknowledgments
Arbejde i laboratoriet blev støttet af postdoc fellowship grant til Dr. Anjali Nandal og sonderende tilskud fra Maryland Stem Cell Research Fund til BT (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
