في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران
Summary
ميتوفاجي، عملية إزالة تلف الميتوكوندريا، أمر ضروري لصيانة التوازن والصحة المتقدرية. تقدم هذه المقالة بعض ميتوفاجي أحدث أساليب الكشف في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيسوالفئران.
Abstract
الميتوكوندريا هي القوى للخلايا وإنتاج الطاقة الخلوية على شكل ATP. ويسهم خلل mitochondrial الشيخوخة البيولوجية ومجموعة متنوعة من الاضطرابات بما في ذلك الأمراض الأيضية ومتلازمات الشيخوخة المبكرة وأمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD). المحافظة على الصحة المتقدرية يتوقف على نشوء حيوي mitochondrial وتطهير كفاءة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من خلال ميتوفاجي. وقد تم تحدي الأساليب التجريبية لدقة الكشف عن أوتوفاجي/ميتوفاجي، لا سيما في نماذج حيوانية، لتطوير. وقد مكن التقدم المحرز مؤخرا نحو فهم الآليات الجزيئية ميتوفاجي تطوير تقنيات الكشف عن ميتوفاجي الرواية. وهنا، نحن نقدم عدة تقنيات متعددة لرصد ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيس (مثلاً، روزيللا وسلالات DCT-1/1 لج)، والفئران (طن متري-كيما). سيتم تحسين دقة القياسات ميتوفاجي توليفة من هذه التقنيات الكشف عن ميتوفاجي، بما في ذلك تقييم الأنواع الصليب، ويؤدي إلى فهم أفضل لدور ميتوفاجي في الصحة والمرض.
Introduction
ميتوفاجي ضروري لصيانة المتقدرية. الميتوكوندريا تتقاطع مع خلية متعددة مما يشير إلى مسارات وهي العضيات الخلوية الفرعية العالمية المسؤولة عن إنتاج الطاقة الخلوية واستقلاب الخلية، والكالسيوم التوازن1،2،3، 4-الميتوكوندريا باستمرار تجربة التحديات من مصادر داخلية وخارجية، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) وسميات المتقدرية، على التوالي، مما يؤدي إلى توليد الميتوكوندريا “المسنين” والمختلة وظيفيا. تراكم من الميتوكوندريا التالفة يقلل من كفاءة إنتاج ATP مع زيادة مقدار روس الضارة، وارتبط بالأمراض المرتبطة بالسن مثل الأمراض الأيضية، والإعلانات، وشعبة المشتريات1،5،6 . لمنع حدوث خلل الميتوكوندريا التي يسببها الخلوي، وصف الخلايا ضرورة الاعتراف على وجه التحديد تلف الميتوكوندريا وكفاءة إزالتها من خلال عملية خلوية أوتوفاجي الميتوكوندريا (ميتوفاجي). وهذا يدل على أهمية ميتوفاجي في الصحة والمرض يوضح الحاجة إلى أساليب دقيقة وفعالة للكشف عن ميتوفاجي في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.
ميتوفاجي عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على كثير من البروتينات والبروتين المجمعات5،،من78. باختصار، أولاً ميتوكندريا تالفة معترف به وغارقة فاجوفوري ميمبرانيد مزدوجة، التي يمكن أن تنشأ من غشاء البلازما أو هيولى، مجمع غولجي، نواة، أو ميتوكندريا نفسها9،10. فاجوفوري كروية الغضروفي والأختام في نهاية المطاف الميتوكوندريا الداخل، التي تشكل أوتوفاجوسومي الميتوكوندريا (ميتوفاجوسومي). ثم الصمامات ميتوفاجوسومي مع يحلول للتدهور، تشكل أوتوليسوسومي التي يكون فيها ميتوكندريا التالفة المتدهورة وإعادة تدويرها7،8. تشمل البروتينات أوتوفاجيك الرئيسية أيضا المشاركة في ميتوفاجي: أوتوفاجي 7 ذات الصلة (ATG7) و Beclin1 (بدء)، “البروتين ميكروتوبولياسوسياتيد” 1A/1B-الضوء سلسلة 3 (LC3 II) (1 لج في العجان جيم-s) و p62 (مكونات فاجوفوري)، و غشاء الليزوزومية المرتبطة بروتين سكري 2 (LAMP2)6،7. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة بروتينات أساسية فريدة من نوعها إلى ميتوفاجي، بما في ذلك 1 كيناز المفترضة التي يسببها فتن (الوردي-1)، Parkin1، كاتشين النووية دوت البروتين 52 (NDP52)، أوبتينيورين، BCL2 التفاعل البروتين 3 مثل (نيكس/BNIP3L) (DCT-1 في C. ايليجانس)، بينها5،،من611.
أسلوب شائع لكشف التغيرات في مستويات أوتوفاجي بنسبة LC3-ثانيا/LC3-أنا أو LC3-ثانيا/أكتين. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير محدد، كما قد تعكس زيادة في نسبة هذا التكريس زيادة أو انصهار البصر من ميتوفاجوسومي إلى يحلول12. هو أسلوب آخر لتقييم كولوكاليزيشن بين علامة أوتوفاجي (مثلاً، LC3) وبروتين المتقدرية (مثلاً، ترانسلوكاسي من الخارجي Mitochondrial غشاء 20 (TOMM20، التي يمكن أن تكون قد أفسدتها proteasomes)). ومع ذلك، هذا يمكن أن تشير فقط إلى التغيرات في مستويات إجمالي ميتوفاجي ولا يمكن التمييز درجات في الانسداد الذي يحدث. ويمكن توضيح ذلك باستخدام مثبطات الليزوزومية (مثلاً، E64d + بيبستاتين أ، يطلق عليها الجيش الشعبي) بالتوازي ليسبب تراكم ميتوفاجوسوميس. يمكن الإشارة إلى الفرق بين عدد ميتوفاجوسوميس في الأساس وعدد ميتوفاجوسوميس بعد العلاج مع الجيش الشعبي ميتوفاجي. وأدت هذه القيود على تطوير تقنيات الكشف عن ميتوفاجي الرواية. ونظرا للأهمية المتزايدة ميتوفاجي في طائفة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، فإننا نقدم عدة تقنيات الكشف ميتوفاجي القوية التي قد تكون مفيدة للباحثين. تشمل التقنيات على حد سواء في المختبر و في فيفو ونوصي بالجمع بين عدة تقنيات للتحقق من التغييرات في ميتوفاجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتطالب تقنيا دقيقة لقياس ميتوفاجي. وهنا، وقد قدمنا العديد من التقنيات القوية التي تسمح لكلا كشف ميتوفاجي النوعي والكمي لمستويات ميتوفاجي في النماذج التجريبية الأكثر شيوعاً في المختبر.
للحصول على بيانات قابلة للنسخ المتماثل، ضروري تصميم تجريبي مع تكرار البيولوجية ثلاثة ع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور أتسوشي ميياواكي والدكتور ريتشارد ج. يول لتقاسم بلازميد كيما طن متري وطن متري-كيما المتكاملة خلايا هيلا. ونحن نشكر حسام ألف شآمنا والدكتورة ديبورا لام كروتو لقراءة نقدية من المخطوطة. هذا البحث يدعمه “برنامج البحوث الداخلية” “المعهد الوطني للصحة” (فب)، منح المعهد الوطني للشيخوخة، فضلا عن الفترة 2014-2015 ومختبر داخل 2016-2017 نيا (EFF، فب). وأيده ممثل المؤسسة “ﻷمراض هيلسي” سور–معاهدة الفضاء الخارجي (رقم المشروع: 2017056) و “مجلس البحوث في النرويج” (رقم المشروع: 262175).
مساهمات مقدم البلاغ:
المؤسسة تصميم المخطوطة وإعداد المشروع؛ KP، NS، EMF، RDS، جسك، ساك، YH واد كتب مقاطع مختلفة من الورقة؛ NT، JP، حماد، و VAB تنقيح المخطوط وتقديم الخبرة الفنية.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
