In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris
Summary
Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.
Abstract
Les mitochondries sont les puissances des cellules et produisent de l’énergie cellulaire sous forme d’ATP. Dysfonctionnement mitochondrial contribue au vieillissement biologique et une grande variété de troubles y compris les maladies métaboliques, maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP) et les syndromes de vieillissement prématuré. Maintien d’une santé mitochondriale dépend de la biogenèse mitochondriale et le déminage efficace de dysfonctionnels mitochondries par l’intermédiaire de mitophagy. Des méthodes expérimentales pour détecter avec précision l’autophagie/mitophagy, en particulier dans des modèles animaux, ont été difficiles à développer. Les progrès récents vers la compréhension des mécanismes moléculaires de mitophagy a permis le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Ici, nous présentons plusieurs techniques polyvalents pour surveiller les mitophagy dans les cellules humaines, Caenorhabditis elegans (p. ex., Rosella et souches DCT-1 / LGG-1) et les souris (mt-Keima). Une combinaison de ces techniques de détection de mitophagy, y compris l’évaluation interspécifique, améliorera la précision des mesures mitophagy et conduire à une meilleure compréhension du rôle de mitophagy dans la santé et la maladie.
Introduction
Mitophagy est essentiel pour fonctionnement mitochondrial. Les mitochondries croisent de multiples voies de signalisation de cellulaire et sont des organites subcellulaires universels responsables de la production d’énergie cellulaire et métabolisme cellulaire calcium homeostasis1,2,3, 4. mitochondries constamment expérience défis provenant de sources endogènes et exogènes, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et substances toxiques mitochondriales, respectivement, qui conduisent à la génération des « âgés » et dysfonctionnels mitochondries. Diminue l’efficacité de la production d’ATP tout en augmentant la quantité de ROS nuisibles accumulation des mitochondries endommagés et a été liée à des maladies liées au vieillissement telles que les maladies métaboliques, AD et PD1,5,6 . Pour éviter tout dysfonctionnement cellulaire induite par les mitochondries, cellules nécessité de reconnaître spécifiquement endommagé les mitochondries et leur enlever efficacement grâce à un processus cellulaire appelé autophagie mitochondriale (mitophagy). Cela démontre l’importance des mitophagy en santé et maladie illustre la nécessité de méthodes précises et efficaces détecter les mitophagy in vitro et in vivo.
Mitophagy est un processus de plusieurs étapes impliquant de nombreuses protéines et protéines complexes5,7,8. En bref, une mitochondrie endommagée est tout d’abord reconnue et engloutie par une double membrane phagophore, qui peut provenir de la membrane plasmique, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, noyau ou mitochondrie lui-même9,10. Le phagophore sphérique s’allonge et finalement scelle les mitochondries à l’intérieur, qui constitue l’autophagosome mitochondriale (mitophagosome). Le mitophagosome fusionne alors avec le lysosome pour dégradation, formant un autolysosome dans lequel la mitochondrie endommagée est dégradée et recyclé7,8. Principales protéines autophagiques également impliqués dans mitophagy comprennent : Autophagy Related 7 (ATG7) et Beclin1 (initiation), protéine Microtubule-Associated 1 a/1 b-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 s elegan c.) et p62 (composants de phagophore), et glycoprotéine de la membrane lysosomale associés à 2 (LAMP2)6,7. En outre, il y a plusieurs protéines essentielles propres à mitophagy, y compris induite par le gène PTEN putatif Kinase 1 (rose-1), Parkin1, Dot nucléoprotéines 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 Interacting Protein 3 comme (NIX/BNIP3L) (DCT-1 chez c. elegans), entre autres5,6,11.
Une méthode courante pour détecter des changements dans les niveaux de l’autophagie est par le ratio du LC3-II/LC3-I ou LC3-II/actine. Toutefois, cette méthode est non spécifique, comme une augmentation de ce ratio peut refléter une ouverture accrue ou une fusion avec facultés affaiblies de mitophagosome au lysosome12. Une autre méthode consiste à évaluer la colocalisation entre un marqueur d’autophagie (p. ex., LC3) et une protéine mitochondriale (p. ex., Translocase of externe mitochondriale Membrane 20 (TOMM20, qui peuvent être dégradés par protéasomes)). Cependant, ceci peuvent seulement indiquer les changements dans les niveaux de mitophagy total et ne peut pas distinguer les étapes à laquelle blocage se produit. Cela peut être clarifié en utilisant des inhibiteurs lysosomales (p. ex., E64d + pepstatine A, appelés EP) en parallèle pour causer l’accumulation de mitophagosomes. La différence entre le nombre de mitophagosomes au départ et le nombre de mitophagosomes après un traitement avec l’EP peut indiquer mitophagy. Ces limitations ont incité le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Compte tenu de l’importance croissante des mitophagy dans un large éventail de maladies humaines, nous présentons plusieurs techniques de détection de mitophagy robuste qui peuvent être utiles pour les chercheurs. Nous couvrir les techniques in vitro et in vivo et recommandons de combiner plusieurs techniques pour vérifier les changements de mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une mesure précise de mitophagy est techniquement difficile. Ici, nous présentons plusieurs techniques robustes qui permettent les deux détection qualitative des mitophagy et quantification des niveaux mitophagy dans les modèles expérimentaux de laboratoire courantes.
Acquisition de données réplicables, un modèle expérimental au moins trois répétitions biologiques est nécessaire. Tous les chercheurs impliqués dans l’expérimentation et l’analyse doivent être aveugle aux ident…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions m. Atsushi Miyawaki et Dr. Richard J. Youle partage le plasmide Keima-mt et mt-Keima intégré les cellules Hela. Nous remercions Raghavendra A. Shamanna et Dr. Deborah L. Croteau de la lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de la NIH (VAB), l’Institut National sur le vieillissement, mais aussi un 2014-2015 et 2016-2017 NIA intra-laboratoire accordent (FEP, VAB). EFF a été pris en charge par HELSE DORS-OST RHF (projet No : 2017056) et le Conseil norvégien de la recherche (projet No : 262175).
CONTRIBUTIONS DE L’AUTEUR :
EFF conçu le manuscrit et préparé l’ébauche ; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH et ED a écrit des différentes sections du document ; NT, JP, HN et VAB révisé le manuscrit et a fourni son expertise.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
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