Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti
Summary
Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.
Abstract
Mitokondri güçlüdür hücre vardır ve ATP şeklinde hücresel enerji üretmek. Biyolojik yaşlanma ve metabolik hastalıklar, erken yaşlanma sendromları ve nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD) gibi gibi bozukluklar çok çeşitli mitokondrial disfonksiyon katkıda bulunur. Mitokondrial Biyogenez ve işlevsel olmayan mitokondri mitophagy aracılığıyla verimli boşluk mitokondrial sağlık bakım bağlıdır. Doğru bir şekilde autophagy/mitophagy, özellikle hayvan modellerinde, algılamak için deneysel yöntemleri geliştirmek için zor oldu. Mitophagy moleküler mekanizmaları anlama yolunda son ilerleme roman mitophagy algılama teknikleri gelişimini sağlamıştır. Burada, mitophagy insan hücrelerinde Caenorhabditis elegans izlemek için çeşitli teknikler çok yönlü tanıtmak (örneğin, Rosella ve DCT-1 / LGG-1 suşları) ve fare (mt-Keima). Türler arası değerlendirme, dahil olmak üzere bu mitophagy algılama teknikleri bir arada mitophagy ölçümlerin doğruluğunu geliştirmek ve daha iyi sağlık ve hastalığında mitophagy rolünü anlamak için yol.
Introduction
Mitophagy mitokondrial bakımı için önemlidir. Mitokondri birden çok hücre sinyal yolları kesişir ve evrensel alt hücre organelleri hücresel enerji üretimi, hücre metabolizması ve kalsiyum homeostazı1,2,3, sorumlu olan 4. mitokondri sürekli deneyimi zorluklar Reaktif oksijen türleri (ROS) ve mitokondriyal toxicants gibi endojen ve eksojen kaynaklardan sırasıyla hangi kurşun “yaşlı” ve işlevsel olmayan mitokondri üretimi için. Hasarlı mitokondri birikimi zararlı ROS miktarını artırarak sırasında ATP üretim verimliliğini azaltır ve yaşa bağlı hastalıklar gibi metabolik hastalıklar, reklam, bağlı ve PD1,5,6 . Mitokondri indüklenen hücresel fonksiyon bozukluğu önlemek için özellikle zarar mitokondri tanımak ve verimli bir şekilde bir hücresel süreç boyunca kaldırmak için hücreleri ihtiyaç mitokondrial autophagy (mitophagy) olarak adlandırdığı. Bu mitophagy sağlık önemi gösterdi ve hastalığı mitophagy algılamak doğru ve verimli yöntemleri ihtiyacını göstermektedir vitro ve içinde vivo.
Mitophagy pek çok protein ve protein kompleksleri5,7,8içeren çok adımlı bir işlemdir. Kısacası, hasarlı bir mitokondri ilk tanınan ve plazma zarı, endoplazmik retikulum, Golgi kompleksi, çekirdeği veya mitokondri kendisi9,10gerçekleşebilir bir çift membraned phagophore tarafından yuttu. Küresel phagophore uzar ve sonunda içinde mitokondriyal autophagosome (mitophagosome) oluşturan mitokondri mühürler. Mitophagosome sonra bozulması, hasarlı mitokondri bozulmuş ve geri dönüşümlü7,8olduğu bir autolysosome oluşturan lysosome ile birleştirir. Büyük autophagic proteinler de mitophagy içinde yer alan içerir: Autophagy ilgili 7 (ATG7) ve Beclin1 (inisiyasyon), Microtubule-Associated Protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3-II) (LGG-1 C. elegans) ve p62 (phagophore bileşenleri), ve ilişkili lizozomal membran glikoprotein 2 (LAMP2)6,7. Ayrıca, birkaç temel proteinler PTEN kaynaklı sözde kinaz 1 (pembe-1), Parkin1, nükleer nokta Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 etkileşim Protein 3 gibi (NIX/BNIP3L) (DCT-1, C. elegans‘) de dahil olmak üzere mitophagy için benzersiz diğerleri arasında5,6,11.
Autophagy seviyelerinde değişiklikleri algılamak için kullanılan genel yöntem tarafından LC3-II/LC3-ı veya LC3-II/aktin oranıdır. Ancak, bu oran artışı artan bir inisiyasyon veya mitophagosome lysosome12Engelli bir füzyonu yansıtıyor olabilir gibi bu yöntem nonspesifik,. Colocalization bir autophagy işaretleyici (örneğin, LC3) ve mitokondriyal bir protein (örneğin, translokaz, dış mitokondri zar 20 (TOMM20, hangi proteasomes tarafından bozulmuş)) arasında değerlendirmek için başka bir yöntemdir. Ancak, bu yalnızca toplam mitophagy seviyelerinde değişiklik gösterebilir ve adım (lar) ayırt edemez hangi tıkanıklık oluşur. Bu mitophagosomes birikimi neden paralel olarak lizozomal inhibitörleri (örneğin, E64d + Pepstatin A, olarak adlandırdığı EP) kullanarak açıklık. Mitophagosomes temel, sayısı ve tedavi EP ile aşağıdaki mitophagosomes sayısı arasındaki farkı mitophagy belirtebilirsiniz. Bu sınırlamalar roman mitophagy algılama teknikleri geliştirilmesi isteniyor. Mitophagy insan hastalıkların geniş bir spektrumda artan alaka içinde görüş-in, biz araştırmacılar için yararlı olabilir birkaç sağlam mitophagy algılama teknikleri mevcut. Vitro ve in vivo teknikler kapak ve mitophagy değişiklikleri doğrulamak için bir çok teknik birleştirerek öneririz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitophagy doğru ölçüm teknik olarak talep ediyor. Burada, biz mitophagy her iki nitel algılama ve miktar mitophagy düzeylerinin en yaygın laboratuvar deneysel modeller için izin birkaç güçlü teknikleri sundu.
Yinelenebilir verisini almak için en az üç biyolojik tekrarlar deneysel bir tasarımla gereklidir. Tüm araştırmacılar deneme ve analiz dahil deney grubu kimliklere kör olmalı. Ayrıca, alanları görüntüleme rastgele resim alma sırasında seçilmelidir. Hücre kül…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz doktor Atsushi Miyawaki ve Dr Richard J. Youle mt-Keima plazmid paylaştığınız için teşekkür ederiz ve mt-Keima Hela hücreleri entegre. Raghavendra A. Shamanna ve Dr Deborah L. Croteau el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu araştırma Intramural araştırma programı NIH (VAB) tarafından desteklenen, yaşlanma, hem de 2014-2015 Ulusal Enstitüsü ve 2016-2017 NIA Intra-laboratuvar (EFF, VAB) verin. EFF HELSE SOR-OST RHF tarafından desteklenen (Proje No: 2017056) ve Norveç Araştırma Konseyi (Proje No: 262175).
YAZAR KATKILARI:
EFF el yazması tasarlanmış ve taslak hazır; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH ve ED kağıdın farklı bölümlerini yazdı; NT, JP, HN ve VAB el yazması gözden geçirilmiş ve uzmanlık sağlanan.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
