במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים
Summary
Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.
Abstract
המיטוכונדריה הם תחנות כוח של תאים, לייצר תאי אנרגיה בצורת ATP. תפקוד מיטוכונדריאלי תורמת להזדקנות ביולוגית ועוד מגוון רחב של מחלות כולל מחלות מטבוליות, תסמונות הזדקנות מוקדמת של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD). שמירה על הבריאות מיטוכונדריאלי תלוי מיטוכונדריאלי להן את סיווג יעיל של המיטוכונדריה לקוי דרך mitophagy. שיטות נסיוניות כדי לזהות במדויק autophagy/mitophagy, בעיקר במודלים של בעלי חיים, יש כבר מאתגר לפתח. התקדמות אחרונים לקראת להבנת המנגנון המולקולרי של mitophagy אפשרה הפיתוח של הרומן mitophagy זיהוי טכניקות. כאן, אנו מציגים מספר טכניקות רב-תכליתי לעקוב אחר mitophagy בתאים אנושיים, Caenorhabditis elegans (למשל, רוזלה וללחצים DCT-1 / איג-1), ועכברים (mt-Keima). שילוב של שיטות זיהוי אלה mitophagy, כולל הערכה קרוס-מינים, לשפר את הדיוק של מדידות mitophagy, להוביל הבנה טובה יותר של התפקיד של mitophagy על בריאות ומחלה.
Introduction
Mitophagy חיוני לצורך תחזוקה מיטוכונדריאלי. המיטוכונדריה מצטלבים תא מספר מסלולי איתות והם organelles תת סלולרית אוניברסלית אחראי על ייצור האנרגיה התאית, מטבוליזם התא, ו סידן הומאוסטזיס1,2,3, 4. המיטוכונדריה כל הזמן לחוות אתגרים ממקורות אנדוגני, אקסוגני, כגון מינים חמצן תגובתי (ROS), חשיפה לרעלים מיטוכונדריאלי, בהתאמה, אשר יובילו הדור של המיטוכונדריה “גיל” ולא מתפקד. הצטברות של המיטוכונדריה פגום מקטין את יעילות ייצור ATP תוך הגדלת הכמות של ROS מזיקים, נקשר מחלות הקשורות כגון מחלות מטבוליות, לספירה, ו- PD1,5,6 . כדי למנוע תפקוד הסלולר המיטוכונדריה המושרה, תאים צורך במיוחד מזהים פגום המיטוכונדריה ולהסיר אותם ביעילות באמצעות תהליך הסלולר כינה autophagy מיטוכונדריאלי (mitophagy). כך מבהירים את החשיבות של mitophagy בריאות, מחלות ממחישה את הצורך בשיטות מדויק ויעיל לגילוי mitophagy גם במבחנה וגם בתוך vivo.
Mitophagy הוא תהליך מרובה-צעד מעורבים רבים חלבונים, חלבונים מתחמי5,7,8. בקצרה, מיטוכונדריון פגום הוא קודם מזוהה, נבלע על ידי phagophore כפול-membraned, אשר יכולות לנבוע מן קרום פלזמה, רשתית תוך-פלזמית, הגולגי, גרעין, או מיטוכונדריון עצמה9,10. Phagophore כדורית לתרמיל, בסופו של דבר חותמות המיטוכונדריה בפנים, המהוות את autophagosome מיטוכונדריאלי (mitophagosome). Mitophagosome בין אז עם ליזוזום עבור השפלה, ויוצרים autolysosome בו מיטוכונדריון פגום הוא מפורק וממוחזרים7,8. חלבונים autophagic הגדולות גם מעורב mitophagy כוללים: Autophagy קשורים 7 (ATG7), Beclin1 (ייזום), חלבון Microtubule-Associated 1A/1B-אור שרשרת 3 (LC3-II) (איג-1 ב- s elegan ג) ו- p62 (מרכיבי phagophore), ו הממברנה lysosomal-הקשורים גליקופרוטאין 2 (LAMP2)6,7. בנוסף, ישנם מספר חלבונים חיוניים ייחודיים ל- mitophagy, כולל PTEN-induced בשם קינאז 1 (ורוד-1), Parkin1, נקודה גרעיני חלבון 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 אינטראקציה חלבון 3 כמו (ניקס/BNIP3L) (DCT-1 C. elegans), בין היתר5,6,11.
שיטה נפוצה כדי לזהות שינויים ברמות של autophagy היא על ידי היחס של LC3-II/LC3-אני או LC3-II/אקטין. עם זאת, שיטה זו היא לא ספציפית, כמו עלייה יחס זה עשוי לשקף חניכה מוגבר או של פיוז’ן לקוי של mitophagosome ליזוזום12. שיטה נוספת היא להעריך את colocalization בין סמן autophagy (למשל, LC3) חלבון מיטוכונדריאלי (למשל, Translocase של החיצוני מיטוכונדריאלי ממברנה 20 (TOMM20, אשר יכול להיות מושפל על-ידי proteasomes)). עם זאת, זה יכול רק להצביע על שינויים ברמות mitophagy הכולל, מבדילה את step(s)-חסימה אשר מתרחשת. זה יכול להיות מובהר באמצעות מעכבי lysosomal (למשל, E64d + Pepstatin A, הנקרא EP) במקביל כדי לגרום להצטברות של mitophagosomes. ההבדל בין מספר mitophagosomes בנקודת ההתחלה ואת המספר של mitophagosomes לאחר הטיפול עם EP יכול לציין mitophagy. מגבלות אלה עוררו את התפתחות טכניקות הרומן mitophagy. לאור הרלוונטיות הגוברת של mitophagy במגוון רחב של מחלות האדם, אנו מציגים מספר טכניקות לזיהוי mitophagy חזקים אשר עשוי להיות שימושי עבור חוקרים. לכסות גם במבחנה וגם ויוו טכניקות ואנו ממליצים על שילוב של מספר טכניקות כדי לוודא שינויים של mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידה מדויקת של mitophagy הוא תובעני מבחינה טכנית. . הנה, הוצגו מספר טכניקות חזקים המאפשרים הן זיהוי איכותי של mitophagy, כימות של רמות mitophagy בדגמי ניסויי מעבדה הנפוץ ביותר.
לרכוש לנתונים ניתן לשכפול, עיצוב ניסיוני עם חזרה ביולוגית לפחות שלושה נחוצה. מעורב ניסויים וניתוח כל החוקרים חי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המייאוואקי אטסשי ד ר ו ד ר ריצ’רד ג’ Youle על שיתוף את פלסמיד mt-Keima, mt-Keima משולב הלה תאים. אנו מודים עדי שי א Shamanna, ד ר דבורה ל’ Croteau על קריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH (VAB), המכון הלאומי להזדקנות, כמו גם של 2014-2015 ו- 2016-2017 ניא אינטרה-מעבדה הענק (EFF, VAB). EFF נתמכה על ידי HELSE RHF סור-אוסט (פרוייקט לא: 2017056), מועצת המחקר של נורבגיה (פרוייקט לא: 262175).
תרומות מחבר:
EFF עיצב את כתב היד והכינו את הטיוטה; KP, מניטובה, EMF, RDS, JSK, שק, יד הנדיב ו אד כתב חלקים שונים של הנייר; NT, JP, ח נ ו VAB תוקן כתב היד וסיפק מומחיות.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
