In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の
Summary
Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy のいくつかに、ひと細胞、線虫マウスの検出方法を示します。
Abstract
ミトコンドリアは細胞の強豪であり、ATP の形で細胞のエネルギーを作り出します。ミトコンドリアは、生物学的老化、代謝性疾患、早期老化症候群とアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの神経変性疾患を含む疾患のさまざまな貢献しています。ミトコンドリアの健康維持は、ミトコンドリア生合成と mitophagy を介して機能不全のミトコンドリアの効率的な通関に依存します。動物モデルで特にオートファジー/mitophagy を正確に検出するための実験方法は、開発に挑戦されています。Mitophagy の分子機構の理解に向けての最近の進歩は、新しい mitophagy 検出技術の開発を可能にしました。ヒトの細胞、線虫mitophagy を監視するいくつかの汎用性の高いテクニックをご紹介 (例えばローゼラと DCT 1/LGG-1 系統)、およびマウス (mt 桂馬)。クロス種の評価を含む、これらの mitophagy 検出手法の組み合わせが mitophagy 測定の精度の向上し、健康および病気の mitophagy の役割の理解に 。
Introduction
Mitophagy は、ミトコンドリアのメンテナンスは欠かせません。ミトコンドリアは複数の細胞シグナル伝達経路が交差して普遍的な細胞内小器官カルシウム恒常性1,2,3、 、細胞の代謝、細胞のエネルギー生産を担当4. ミトコンドリア絶えず、活性酸素種 (ROS) やミトコンドリア毒性など内因性と外因性の源からの課題,「高齢者」および機能不全のミトコンドリアの生成に 。傷害ミトコンドリアの蓄積は有害な活性酸素の量を増加させながら ATP 生産効率を低下させる、広告、代謝性疾患など加齢に伴う疾患にリンクされていると PD1,5,6.誘導ミトコンドリア細胞機能障害を防ぐためには、細胞に必要な特に認識してミトコンドリアを損傷し効率的に細胞プロセスを削除するはミトコンドリア オートファジー (mitophagy) と呼ばれます。これは mitophagy の健康の重要性を実証し、病気が mitophagy を検出する正確かつ効率的な方法の必要性を示していますの in vitroとin vivoの両方。
Mitophagy は、多くのタンパク質やタンパク質複合体5,7、8を含む複数段階のプロセスです。簡単に言えば、破損したミトコンドリアがまず認識および9,10膜、小胞体、ゴルジ複合体、核、またはミトコンドリア自体から起きることができる二重機能を担った phagophore によって包まれています。球状 phagophore を延長し、最終的にミトコンドリア ミトコンドリア オートファゴソーム (mitophagosome) を構成する内部のシールします。Mitophagosome、劣化、破損したミトコンドリアは劣化とリサイクル7、8autolysosome の形成のリソソームと融合しています。Mitophagy にも関与する主要なオートファジー蛋白質を含める: オートファジー関連 7 (atg 7生) と Beclin1 (開始)、Microtubule-Associated 蛋白質 1A 1B 光チェーン 3 (LC3 II) ( C. elegans で LGG-1) と p62 (phagophore のコンポーネント) とリソソーム膜糖タンパク質 2 (LAMP2)6,7。また、mitophagy、PTEN による推定のキナーゼ 1 (ピンク 1)、Parkin1、核ドット蛋白質 52 kDa (NDP52)、BCL2 の相互作用蛋白質 3 のような (炎の使い手ニクス/BNIP3L) (DCT 1線虫)、緑内障などにユニークないくつかの重要な蛋白質があります。他の人の間で5,6,11。
オートファジーのレベルの変化を検出する共通の方法は LC3-II/LC3 I または II/LC3 アクチンの比です。ただし、この方法は非特異的、この比率の増加は、増加の開始またはリソソーム12mitophagosome の障害の融合を反映可能性があります。(例えばLC3) のオートファジーのマーカーおよびミトコンドリア蛋白質 (例えばTranslocase の外側ミトコンドリア膜 20 (TOMM20、プロテアソームによって低下する可能性があります)) 間の共存を評価する別の方法です。ただし、合計 mitophagy レベルの変化を示すだけことができます、手順を区別できないどの閉塞で発生します。これは並列 mitophagosomes の蓄積を引き起こすライソゾーム阻害剤 (例えばE64d + ペプスタチン A EP と呼ばれる) を使用して明らかにすることができます。ベースラインで mitophagosomes の数と次の EP と治療 mitophagosomes の数の違いは、mitophagy を示すことができます。これらの制限は、新規 mitophagy 検出技術の開発を求めています。人間の病気の広いスペクトルの mitophagy の増加の関連性の観点から研究者の役に立つかもしれないいくつかの堅牢な mitophagy 検出手法を提案する.我々 は両方の in vitroとin vivoのテクニックをカバーし、mitophagy の変更を確認する複数のテクニックを組み合わせることをお勧めします。
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitophagy の正確な測定は技術的に要求しています。ここでは、我々 は mitophagy の両方の定性的検出と最も一般的な実験室の実験モデルで mitophagy レベルの定量化を可能にする堅牢な手法を提示しています。
レプリケート可能なデータを取得するには、少なくとも 3 つの生物学的繰り返しで実験デザインが必要です。実験や解析に関与するすべての研究者は、実験グループ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mt 桂馬プラスミドを共有、宮脇敦史博士と博士リチャード j. もちろん感謝、mt 桂馬は Hela 細胞を統合します。原稿の重要な読書、Raghavendra a. Shamanna と博士デボラ ・ l ・ croteau さんに感謝します。この研究は、NIH (VAB) の学内研究によって支えられた、2014-2015 と同様、高齢化、国立研究所と 2016-2017 NIA の内研究室 (EFF、VAB) を付与します。EFF は HELSE SOR OST RHF によって支えられた (プロジェクト No: 2017056)、ノルウェーの研究評議会 (プロジェクト No: 262175)。
著者の貢献:
EFF は、原稿を設計し、下書きを準備KP、NS、EMF、RDS、ジャンパー スカート、SAC、YH、エドを書いた用紙の別のセクションNT、JP、HN、VAB 原稿し、専門知識を提供します。
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
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