CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出
Summary
ローダミン 123 ミトコンドリア膜電位 (MMP) を識別し、CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの生体外の研究の適用のための詳しいプロトコルをご紹介します。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変更が記録されました。
Abstract
ミトコンドリア膜電位 (MMP, ΔΨm) の枯渇は、アポトーシスのカスケードの最も早いイベントと見なされます。それは先に核のアポトーシス特性、chromatin の凝縮、DNA の破損なども発生します。一度 MMP 崩壊、細胞のアポトーシスは不可逆的に開始されます。脂溶性のカチオン染料のシリーズ細胞膜を通過し、ミトコンドリアのマトリックス内の集計、や MMP の変化を評価するための蛍光マーカーとして役立ちます。Cl–細胞内チャネル (CLIC) 家族の 6 人のメンバーの 1 つとして CLIC4 はミトコンドリア経路を中心に細胞アポトーシス プロセスに参加します。ローダミン 123 (Rh123) CLIC4 ノックダウンで誘導されるアポトーシスを学ぶ私たちの蛍光変動の監視を通じて MMP を測定する詳細なプロトコルについて述べる。利点および共焦点レーザー走査と詳しくは、通常の蛍光顕微鏡のアプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。
Introduction
Rh123 は、膜電位を指標として機能するカチオン性蛍光色素です。Rh123 は、細胞膜を貫通し、1膜内外の電位差によってミトコンドリアのマトリックスを入力が可能です。アポトーシスは、ミトコンドリア膜の完全性の損傷に します。ミトコンドリア透過性遷移ポア (MPTP) が開き、mmp に関しては、ミトコンドリアの外に Rh123 のリリースで、結果の崩壊に 。最後に、蛍光顕微鏡下で強い緑色蛍光シグナルが検出されます。MMP と昇格した膜の透過性の減少が細胞アポトーシス2の初期の兆候であることをも記載されています。したがって、Rh123 は、MMP の変化の検出と細胞のアポトーシスの発生に適用可能性があります。
世界の第 6 最も一般的な癌、頭頸部癌が人の健康3大幅に劣化します。多くのアプローチは、近年開発された、頭頸部扁平上皮癌 (各種) を患っている患者のための治療の治療成績はまだ理想的ではない4。新しい治療法を探る各種5の処理を改善できます。多数の生物学的プロセスを含むイオン チャネルは、さまざまな癌6の開発に重要な役割を表示します。Cl–チャンネルの一部または全部の参加は高メタアナライシス アクティブな移行、増殖、侵襲性の率が高いなどのさまざまなプロパティに関与しています。この点を踏まえて、CLIC、新規なタンパク質ファミリーを治療標的癌治療6、7のための有望なクラスとして記載されています。最近の研究が明らかにした CLIC1、CLIC4、CLIC5 など CLIC の家族のメンバーを心臓のミトコンドリアにローカライズ、活性酸素種 (ROS) レベルは、CLIC5 で誘導されるミトコンドリアにある Clの機能的役割を示す-アポトーシス応答8チャンネル。CLIC4、CLIC の家族 (として知られている mtCLIC、P64H1、および RS43) の 1 つのメンバーは、がん細胞とヒトのミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体を含む細胞レベル下の場所でアポトーシス制御プロパティの最も広く研究されています。ケラチノ サイト7,9,10。CLIC4 の発現は、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、P53 と外部からの刺激によって規制されていた。過剰発現および CLIC4 のカスケードはカスパーゼの活性化とチトクローム C11,のリリース Bcl 2 家族の不均衡を伴うミトコンドリア経路を中心にアポトーシス反応を誘発します。12,13。 したがって、MMP 測定が CLIC4 関連アポトーシスを探索することが重要で、Rh123 は理想的な蛍光インジケーターとして機能します。
本研究では、HN4 細胞における CLIC4 ノックダウンによるアポトーシス誘導を研究する MMP の検出のための詳しいプロトコルについて説明します。Rh123 は、MMP の変化を観察する蛍光プローブとして使用されます。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変動を解決可能性があります。利点および共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡詳細、アプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。このプロトコルは、他のアポトーシス関連の研究にも適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Cl−チャネルの内部環境の止血に欠かせない細胞増殖およびアポトーシス15,16で重要な役割を果たすとされています。したがって、さまざまな癌17より治療的なアプローチを見つけるための大きい必要性と意義はイオン チャネル標的介入とアポトーシスの関係を理解すること。ミトコンドリアは、セルの通常の生物学的状?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
細胞培養のため氏チャオ牙に感謝致します。この作品は中国の自然科学財団 (81371284 許可第 81570403 号); からの補助金によって支えられました。安徽省の自然科学基金 (許可番号 1408085MH158)。安徽省医科大学の優秀な若手研究者安徽省の大学の優秀な若い才能を支援するプログラム。
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
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