Detección del potencial de membrana de las mitocondrias CLIC4 HN4 inducida por la caída de la célula Apoptosis In Vitro
Summary
Aquí presentamos un protocolo detallado para la aplicación de la rodamina 123 para identificar el potencial de la membrana mitocondrial (MMP) y estudiar CLIC4 caída inducida HN4 celular apoptosis in vitro. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, se registró el cambio en tiempo real de la MMP.
Abstract
Agotamiento del potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) se considera el evento más temprano en la cascada apoptótica. Incluso se produce por delante de apoptotic nuclear características, incluyendo la condensación de la cromatina y la rotura de ADN. Una vez que los colapsos MMP, apoptosis celular iniciará irreversible. Una serie de colorantes catiónicos lipofílicos puede pasar a través de la membrana celular y agregado dentro de la matriz de la mitocondria y servir como marcador de fluorescencia para evaluar cambio MMP. Como uno de los seis miembros de Cl– familia canal intracelular (CLIC), CLIC4 participa en el proceso de apoptosis de la célula principalmente a través de la vía mitocondrial. Aquí describimos un protocolo detallado para medir MMP mediante monitoreo de la fluctuación de la fluorescencia de rodamina 123 (Rh123), a través del cual estudiamos apoptosis inducida por CLIC4 caída. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido y microscopio de fluorescencia normal en detalle y también Comparar con otros métodos.
Introduction
Rh123 es un colorante catiónico de la fluorescencia, que sirve como un indicador de potencial transmembrana. Rh123 es capaz de penetrar la membrana celular y entrar en la matriz mitocondrial dependiendo de la diferencia de potencial dentro y fuera de la membrana1. Apoptosis lleva a daño de la integridad de la membrana mitocondrial. El poro de transición de permeabilidad de mitocondria (MPTP) abrirá y conducir al colapso de la MMP, que a su vez resulta en la liberación de Rh123 hacia el exterior de la mitocondria. Por último, se detectarán más fuerte señal de fluorescencia verde bajo microscopio de fluorescencia. Está bien documentado que el agotamiento de la RPP y la permeabilidad de la membrana elevada son signos tempranos de la célula apoptosis2. Por lo tanto, Rh123 puede aplicarse para la detección del cambio MMP y la aparición de apoptosis de las células.
Como el 6 º carcinoma más común en el mundo, cáncer de cabeza y cuello deteriora gravemente de salud3 de una persona. Aunque muchos enfoques fueron desarrollados en los últimos años, resultado clínico del tratamiento para pacientes con carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es todavía no es lo ideal4. Explorar nuevos métodos terapéuticos puede mejorar el tratamiento de HNSCC5. Canales iónicos que implica numerosos procesos biológicos muestran un papel importante en el desarrollo de cánceres diferentes6. Participación total o parcial de los canales de Cl– están altamente implicados en varias propiedades de transformación neoplásica incluyendo migración activa, alta tasa de proliferación e invasividad. A la luz de esto, el CLIC, una familia de proteínas novela, ha sido incluido como una prometedora clase de dianas terapéuticas para el cáncer tratamiento6,7. Estudios recientes han revelado que los miembros de la familia CLIC incluyendo CLIC1, CLIC4 y CLIC5, localización a mitocondrial cardíaco y el nivel de (ROS) las especies reactivas del oxígeno es upregulated por CLIC5, indicando el papel funcional de mitocondrial ubicado Cl – canales en la respuesta apoptótica del8. CLIC4, uno de los miembros de la familia CLIC (también conocido como mtCLIC, P64H1 y RS43), ha sido más ampliamente estudiada por sus propiedades de regulación apoptótica en las células cancerosas y localización subcelular como Golgi, retículo endoplasmático y mitocondria en humanos queratinocitos7,9,10. El perfil de expresión de CLIC4 fue regulado por el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el P53 y el estímulo externo. Sobreexpresión y downregulation de CLIC4 desencadenan una respuesta apoptótica principalmente a través de la vía mitocondrial junto con el desequilibrio de los miembros de la familia Bcl-2 activación de la cascada de caspasas y la liberación de citocromo C11, 12 , 13. por lo tanto, medida de MMP es crucial para explorar CLIC4 relacionados con apoptosis y Rh123 sirve como un indicador de fluorescencia ideal.
El presente estudio describe un protocolo detallado para la detección de MMP para estudiar CLIC4 precipitación inducida por la apoptosis en células de HN4. Rh123 se utiliza como sonda de fluorescencia para observar el cambio de la MMP. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, la fluctuación en tiempo real de la MMP puede resolverse. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia en detalle y también Comparar con otros métodos. Este protocolo también se puede aplicar a otros estudios relacionados con la apoptosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Está bien documentado que Cl− canales son esenciales para mantener la hemostasia del ambiente interno y desempeñan un papel importante en la proliferación celular y apoptosis15,16. Por lo tanto, entender la relación entre la intervención orientada a canales de iones y de la apoptosis es de gran necesidad e importancia para encontrar un mejor enfoque terapéutico para diversos tipos de cáncer17. Las mitocondrias mantienen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le rogamos gracias a Sr. Chao Fang para el cultivo celular. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias naturales de China (Grant no. 81570403, 81371284); Anhui Provincial Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Destacado investigador joven de la Universidad médica de Anhui; Apoyo a programa de excelentes talentos jóvenes en las universidades de la provincia de Anhui.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
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