Erkennung von Mitochondrien-Membran-Potential, CLIC4 Knockdown-induzierte HN4 Zelle Apoptosis In-vitro- Studie
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Anwendung von Rhodamin 123 zu identifizieren das mitochondriale Membranpotential (MMP) und CLIC4 Zuschlag-induzierte HN4 Zelle Apoptosis in-vitro-Studie. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop war die Änderung des Echtzeit-die MMP aufgezeichnet.
Abstract
Erschöpfung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP, ΔΨm) gilt als das früheste Ereignis in der Apoptose-Kaskade. Es kommt sogar vor nuklearen apoptotische Merkmale, einschließlich der Chromatin-Kondensation und DNA-Bruch. Sobald der MMP zusammenbricht, zellapoptose irreversibel einleiten werden. Eine Reihe von lipophilen kationischen Farbstoffen kann durch die Zellmembran passieren und Aggregieren innerhalb der Matrix der Mitochondrien und dienen als Fluoreszenz Marker, MMP Veränderung zu bewerten. Als eines der sechs Mitglieder der CL– intrazelluläre Kanal (CLIC) Familie beteiligt CLIC4 Apoptotic zellprozess vor allem durch den mitochondrialen Weg. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der MMP durch monitoring der Fluoreszenz Fluktuation von Rhodamin 123 (Rh123), durch die wir, Apoptose induziert durch CLIC4 Zuschlag studieren. Wir diskutieren die Vorzüge und Grenzen der Anwendung der konfokalen Laser-scanning- und normal Fluoreszenzmikroskop im Detail und auch mit anderen Methoden vergleichen.
Introduction
Rh123 ist ein kationischen Fluoreszenz-Farbstoff, dient als Indikator für transmembranen Potenzial. Rh123 ist in der Lage, die Zellmembran durchdringen und die Eingabe der mitochondrialen Matrix abhängig von der Potentialdifferenz von innerhalb und außerhalb der Membran-1. Apoptose führt um zu Schäden der Mitochondrien-Membran Integrität. Die Mitochondrium Permeabilität Übergang Pore (MPTP) öffnet und zum Zusammenbruch des MMP, wodurch wiederum die Freisetzung von Rh123 an der Außenseite der Mitochondrien führen. Zu guter Letzt wird stärkeres Signal grün fluoreszieren unter Fluoreszenzmikroskop erkannt werden. Es ist gut dokumentiert, dass die Erschöpfung der MMP und erhöhten Membranpermeabilität sind frühe Anzeichen von Zelle Apoptosis2. Daher kann Rh123 auf die Erkennung von MMP-Änderung und dem Auftreten von zellapoptose angewendet werden.
Als die 6. häufigste Karzinom in der Welt verschlechtert Kopf-und halskrebs stark eine Person Gesundheit3. Obwohl viele Ansätze in den letzten Jahren entwickelt wurden, ist klinische Ergebnisse der Behandlung von Patienten mit Kopf- und Halsbereich Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) noch nicht ideal4. Erkundung neue Therapiemethoden kann die Behandlung für lokal5verbessern. Ionenkanäle, die mit zahlreichen biologischen Prozessen anzeigen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von verschiedenen Krebsarten6 Teilweise oder vollständige Teilnahme der Cl– Kanäle sind sehr verschiedene Eigenschaften der neoplastischen Transformation einschließlich aktive Migration, hohe Rate der Verbreitung und Invasivität beteiligt. Vor diesem Hintergrund wurde die CLIC, ein neuartiges Protein-Familie, als eine viel versprechende Klasse von therapeutischen Ziele für Krebs Behandlung6,7aufgeführt. Neuere Studien haben gezeigt, die Mitglieder der CLIC-Familie, einschließlich CLIC1, CLIC4 und CLIC5, zu lokalisieren, zu kardialen Mitochondrien und reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Niveau hochreguliert durch CLIC5, zeigt die funktionale Rolle der mitochondrialen befindet sich Cl – in der Apoptotic Antwort8Kanäle. CLIC4, ein Mitglieder der CLIC-Familie (auch bekannt als MtCLIC, P64H1 und RS43), wurde weitgehend für seine Apoptotic Verordnung Eigenschaften in Krebszellen und subzelluläre Lage einschließlich Golgi, endoplasmatische Retikulum und Mitochondrium beim Menschen untersucht Keratinozyten7,9,10. Das Expressionsprofil des CLIC4 wurde von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), P53 und äußeren Reiz geregelt. Überexpression und Downregulation der CLIC4 auslösen eine apoptotische Reaktion vor allem durch den mitochondrialen Weg begleitet mit dem Ungleichgewicht von Bcl-2 Familie Mitglieder, Aktivierung der Caspase-Kaskade und Freisetzung von Cytochrom C11, 12 , 13. daher MMP Messung ist entscheidend für die CLIC4 im Zusammenhang mit Apoptose zu erkunden und Rh123 dient als Indikator ideale Fluoreszenz.
Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Detektion von MMP CLIC4 Zuschlag-induzierten Apoptose in HN4 Zellen zu studieren. Rh123 wird als Fluoreszenz Sonde verwendet, um die Änderung der MMP zu beobachten. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop kann die Echtzeit-Schwankung der MMP gelöst werden. Wir diskutieren die Vorzüge und Grenzen der Anwendung der konfokalen Laser-scanning Fluoreszenzmikroskop im Detail und auch mit anderen Methoden vergleichen. Dieses Protokoll kann auch auf andere Apoptose-bezogene Studien angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist gut dokumentiert, dass Cl− Kanäle wesentlich bei der Aufrechterhaltung der Hämostase der internen Umwelt und spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Proliferation und Apoptose15,16. Verständnis der Beziehung zwischen Ionen-Kanal gezielt eingreifen und Apoptose ist daher von großer Bedarf und Bedeutung, einen bessere therapeutische Ansatz für verschiedene Krebsarten17zu finden. Mitochondrien behalten Sie den normale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Chao Fang für die Zellkultur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81570403, 81371284); Anhui Provinz Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Herausragende junge Ermittler der medizinischen Universität Anhui; Rahmenprogramm für exzellente junge Talente an Universitäten der Provinz Anhui.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
