Обнаружение митохондрий мембранного потенциала для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для применения родамин 123 для выявления потенциальных митохондриальной мембраны (СПП) и изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции был записан в реальном времени изменение системы СПП.
Abstract
Истощение митохондриальной мембраны потенциальных (СПП, ΔΨm) считается раннее событие в apoptotic Каскад. Это происходит даже впереди ядерных apoptotic характеристики, включая конденсацию хроматина и поломки ДНК. После того, как рушится ММП, апоптоз клеток будет инициировать необратимо. Ряда липофильных Катионные красители можно пройти через клеточные мембраны и агрегировать внутри матрицы митохондрий и служить флуоресценции маркер для оценки изменения ММП. Как один из шести членов семьи внутриклеточных канал (клик), Cl– CLIC4 участвует в процессе apoptotic клетки главным образом через Митохондриальные пути. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения MMP через мониторинга флуоресценции колебания родамин 123 (Rh123), через который мы изучаем апоптоз, CLIC4 нокдаун. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальное лазерное сканирование и нормальной флуоресцентным микроскопом в деталях, а также сравнить его с другими методами.
Introduction
Rh123 является красителя катионного флуоресценции, который служит индикатором для трансмембранного потенциала. Rh123 способна проникающим клеточной мембраны и ввода митохондриальной матрицы в зависимости от потенциального разница внутри и за пределами мембраны1. Апоптоз приводит к повреждению целостности митохондриальной мембраны. Митохондрии поры проницаемости перехода (MPTP) будет открыт и привести к краху системы СПП, которая в свою очередь приводит в выпуске Rh123 вне митохондрий. Наконец сильный сигнал зеленый флуоресценции будет обнаружен под флуоресцентным микроскопом. Это хорошо документированы, что истощение ММП и повышенные мембран проницаемости являются ранние признаки апоптоз клеток2. Таким образом Rh123 может применяться для обнаружения изменений ММП и возникновение апоптоза клеток.
Как 6 наиболее распространенным раком в мире головы и шеи рак сильно ухудшается здоровье человека3. Хотя в последние годы были разработаны многие подходы, клинические исходы лечения для пациентов, страдающих от головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC)-до сих пор не идеальный4. Изучение новых терапевтических методов может улучшить лечение HNSCC5. Каналы иона с участием многочисленных биологических процессов отображать важную роль в развитии различных видов рака6. Частичное или полное участие Cl– каналов очень участвуют в различных свойств неопластической трансформации, в том числе активной миграции, высокий уровень распространения и инвазии. В свете этого CLIC, Роман белка семьи, были перечислены как перспективный класс терапевтических целей для рака лечение6,7. Недавние исследования показали, что члены семьи CLIC, включая CLIC1, CLIC4 и CLIC5, локализация для сердечной митохондриальных и уровень реактивнооксигенных видов (ров), upregulated, CLIC5, указывающий функциональную роль митохондриальной расположен Cl – каналы в ответ apoptotic8. CLIC4, один из членов семьи CLIC (также известный как mtCLIC, P64H1 и RS43), наиболее широко изучены для регулирования свойств его apoptotic в раковые клетки и внутриклеточных местоположения, включая Гольджи, эндоплазматический ретикулум и митохондрий в человека кератиноциты7,9,10. Выражение профиль CLIC4 регулируется фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), P53 и внешний раздражитель. Сверхэкспрессия и Даунрегуляция CLIC4 спровоцировать реакцию apoptotic главным образом через Митохондриальные пути сопровождается дисбаланс Bcl-2 члены семьи, активацию caspase Каскад и выпуск цитохрома C11, 12 , 13. Таким образом, ММП измерение имеет решающее значение для изучения связанных с CLIC4 апоптоза, и Rh123 служит индикатором идеальной флуоресценции.
Настоящее исследование описывает подробный протокол для обнаружения ММП для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированного апоптоза в HN4 клетках. Rh123 используется в качестве флуоресценции зонда для наблюдения за изменением ММР. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции реального времени колебания МЦП могут быть решены. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции в деталях, а также сравнить его с другими методами. Этот протокол также может применяться для других исследований, связанных с апоптоз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это хорошо документировано что Cl− каналы имеют важное значение в поддержании гемостаз внутренней среды и играют важную роль в клеточной пролиферации и апоптоза15,16. Таким образом понимание взаимосвязи между ионного канала целевой вмешательства и …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы любезно благодарим г-н Chao Fang на культуры клеток. Эта работа была поддержана гранты от фонда естественных наук Китая (Грант № 81570403, 81371284); Аньхой провинциального природного научный фонд (Грант № 1408085MH158); Выдающийся молодой следователь Аньхой медицинского университета; Программа поддержки для отличные молодых талантов в университетах провинции Аньхой.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
