الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا لدراسة CLIC4 HN4 المستحثة بضربه قاضية الخلية المبرمج في المختبر
Summary
وهنا يقدم بروتوكول مفصلة لتطبيق والرودامين 123 للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) تحديد ودراسة CLIC4 المستحثة بضربه قاضية HN4 الخلية المبرمج في المختبر. وسجلت تحت مجهر الأسفار الشائعة والليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار، التغيير في الوقت الحقيقي نظام التمثيل التناسبي المختلط.
Abstract
ويعتبر استنزاف للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (نظام التمثيل التناسبي المختلط، ΔΨm) الحدث تتالي apoptotic بأقرب وقت ممكن. ويحدث ذلك حتى قبل الخصائص apoptotic النووية، بما في ذلك التكثيف الكروماتين والكسر الحمض النووي. متى سيتم بدء انهيار نظام التمثيل التناسبي المختلط، الخلية المبرمج لا رجعة فيه. سلسلة من الأصباغ الموجبة محبتين يمكن تمر عبر غشاء الخلية وتجميع داخل مصفوفة ميتوكندريا، وتكون بمثابة علامة الأسفار لتقييم تغير نظام التمثيل التناسبي المختلط. كواحدة من ستة أعضاء من Cl– الأسرة قناة داخل الخلايا (انقر)، CLIC4 وتشارك في عملية apoptotic الخلية أساسا من خلال المسار المتقدرية. هنا يمكننا وصف بروتوكول مفصلة قياس التمثيل التناسبي المختلط عن طريق رصد تقلبات fluorescence والرودامين 123 (Rh123)، علينا أن ندرس من خلالها المبرمج الناجمة عن ضربة قاضية CLIC4. نحن مناقشة مزايا وقيود التطبيق [كنفوكل] ليزر المسح الضوئي والمجهر الفلورية العادية بالتفصيل، وذلك أيضا مقارنة مع أساليب أخرى.
Introduction
Rh123 هو صبغة fluorescence الأيوني، الذي يخدم كمؤشر لإمكانات transmembrane. Rh123 قادر على اختراق غشاء الخلية وإدخال مصفوفة المتقدرية تبعاً للاختلاف المحتملة من داخل وخارج الغشاء1. [ابوبتوسس] يؤدي إلى الأضرار من سلامة غشاء الميتوكوندريا. وستفتح المسام الانتقال نفاذية ميتوكندريا (MPTP) وتؤدي إلى انهيار نظام التمثيل التناسبي المختلط، الذي يؤدي بدوره في الإفراج عن Rh123 إلى خارج الميتوكوندريا. وأخيراً، سوف يتم الكشف عن أقوى إشارة الفلورية الخضراء تحت مجهر الأسفار. أنها موثقة جيدا أن استنفاد MMP ونفاذيه الغشاء مرتفعة هي العلامات المبكرة للخلايا المبرمج2. ولذلك، قد يكون تطبيق Rh123 الكشف عن تغيير نظام التمثيل التناسبي المختلط، وحدوث استموات الخلايا.
سرطان الأكثر شيوعاً السادسة في العالم، تتدهور سرطان الرأس والرقبة شدة الشخص الصحية3. على الرغم من أن العديد من النهج وضعت في السنوات الأخيرة، هو النتائج السريرية للعلاج للمرضى الذين يعانون من الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) لا تزال غير مثالية4. يمكن استكشاف أساليب علاجية جديدة لتحسين علاج هنسكك5. عرض القنوات الأيونية التي تنطوي على العديد من العمليات البيولوجية دوراً هاما في تطوير مختلف أنواع السرطان6. مشاركة الجزئي أو الكلي لقنوات Cl– يشاركون عاليا في الخصائص المختلفة للورم التحول بما في ذلك الهجرة النشطة، وارتفاع معدل انتشار واختزاع. وفي ضوء هذا، أدرجت انقر، عائلة بروتين رواية، كفئة واعدة من الأهداف العلاجية لعلاج السرطان6،7. وقد كشفت الدراسات الأخيرة أن أفراد الأسرة بما في ذلك CLIC1، CLIC4، و CLIC5، انقر ترجمة للقلب mitochondrial والأكسجين التفاعلية ومستوى الأنواع (روس) هو upregulated من CLIC5، مما يشير إلى دور وظيفي المتقدرية يقع Cl — القنوات في الاستجابة أبوبتوتيك8. CLIC4، أحد أفراد الأسرة انقر (يعرف أيضا باسم متكليك و P64H1 و RS43)، درست أكثر استفاضة لخصائصه التنظيم أبوبتوتيك في الخلايا السرطانية وموقع سوبسيلولار بما في ذلك غولجي وهيولي ميتوكندريا في الإنسان الكيراتينيه7،،من910. صورة CLIC4 التعبير يخضع لعامل نخر الورم-α (تنف-α)، P53، والتحفيز الخارجي. أوفيريكسبريشن ودوونريجوليشن من CLIC4 تؤدي إلى استجابة apoptotic أساسا من خلال المسار المتقدرية مصحوبة باختلال التوازن Bcl-2 أفراد الأسرة، تفعيل caspase تتالي، وإطلاق سراح السيتوكروم ج11، 12 , 13-ولذلك، قياس التمثيل التناسبي المختلط أمر حاسم لاستكشاف المبرمج المتصلة CLIC4، و Rh123 بمثابة مؤشر fluorescence مثالية.
تصف هذه الدراسة بروتوكولا مفصلة للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط لدراسة CLIC4 المستحثة بضربه قاضية المبرمج في الخلايا HN4. Rh123 كتحقيق الأسفار لمراقبة التغيير نظام التمثيل التناسبي المختلط. تحت مجهر الأسفار الشائعة والليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار، التقلب في الوقت الحقيقي نظام التمثيل التناسبي المختلط قد يكون حلها. نحن مناقشة مزايا وقيود تطبيق [كنفوكل] ليزر المسح مجهر الأسفار بالتفصيل، وكذلك مقارنتها مع أساليب أخرى. يمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا إلى الدراسات الأخرى ذات الصلة بالمبرمج.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنها موثقة جيدا أن Cl− قنوات أساسية للحفاظ على الأرقاء البيئة الداخلية وتلعب أدواراً هامة في تكاثر الخلايا والمبرمج15،16. ولذلك، فهم العلاقة بين التدخل المستهدفة لقناة أيون والمبرمج حاجة كبيرة وأهمية إيجاد نهج علاجية أفضل لمختلف أنواع السرطان<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرجى ونشكر السيد شاو فانغ لزراعة الخلايا. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من “مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية” (المنحة رقم 81570403، 81371284)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة آنهوي (رقم المنحة 1408085MH158)؛ محقق شاب المعلقة من جامعة آنهوي الطبية؛ دعم البرنامج لمواهب شابه ممتازة في الجامعات لمقاطعة آنهوي.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
