Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications
Summary
Ce protocole décrit la DÉCELLULARISATION complete du myocarde humaine tout en préservant ses constituants de la matrice extracellulaire. Traitement ultérieur des résultats dans la production de microparticules et un hydrogel auto-assemblage cytoprotecteurs matrice extracellulaire.
Abstract
Préparations de la matrice extracellulaire acellulaire sont utiles pour étudier les interactions cellule-matrice et facilitent les demandes de thérapie régénératrice des cellules. Plusieurs produits commerciaux de la matrice extracellulaire sont disponibles comme les hydrogels ou membranes, mais ceux-ci ne possèdent pas d’activité biologique spécifique des tissus. Car DÉCELLULARISATION de perfusion n’est habituellement pas possible avec les tissus du coeur humain, nous avons développé un procédé de DÉCELLULARISATION d’immersion 3 étapes. Humaines tranches myocardiques achetés au cours de la chirurgie sont d’abord traitées avec tampon de lyse hyperosmolaire sans tensioactifs, suivie d’une incubation avec l’ionique détergent, dodécyl sulfate de sodium, et le processus s’achève en exploitant l’activité DNase intrinsèque des sérum de veau fœtal. Cette technique aboutit à feuilles acellulaire de matrice extracellulaire cardiaque avec en grande partie préservée composition d’architecture et des biopolymères de tissu fibreux, qui apparaissaient pour offrir des repères écologiques spécifiques aux populations de cellules cardiaques et souches pluripotentes cellules. Feuilles de matrice extracellulaire cardiaque peuvent ensuite être encore transformés en une poudre de microparticules sans modification supplémentaire chimique, ou, via la digestion pepsique à court terme, dans un hydrogel auto-assemblage de matrice extracellulaire cardiaque avec conservés bioactivité.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement structurelle soutenir mais est également importante pour la cellule biologique et tissu int1. Dans le coeur, l’ECM participe à la régulation des réponses physiopathologiques comme la fibrose, inflammation, angiogenèse, cardiomyocyte fonction contractile et viabilité et sort de cellules progénitrices résident. En plus de ses principaux composants – glycoprotéines fibreuses, glycosaminoglycanes et protéoglycanes – il contient une foule de facteurs de croissance sécrétés, cytokines et vésicules membraneux contenant des acides nucléiques et protéines2,3.
Récemment, il est devenu clair que les préparations d’ECM acellulaires ne sont pas seulement inestimables pour l’étude des interactions cellule-matrice, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles basés sur les cellules. L’importance d’offrir un environnement adapté aux produits thérapeutiques cellulaires ou tissus ingénieries est maintenant largement reconnu. Ont tenté de combiner des suspensions cellulaires ou des composés actifs avec des hydrogels biopolymères défini4,5,6 ou avec des cocktails de protéines sécrétées par les cellules de sarcome murin (c.-à-d., Matrigel, Geltrex) 7. Toutefois, les anciens ont limité bioactivité, ces derniers sont problématiques dans les processus de qualité GMP, et tous deux n’ont pas la bioactivité spécifique des tissus cardiaques ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
DÉCELLULARISATION du myocarde a précédemment été interprétée par perfusion du cœur tout via le système vasculaire coronaire14,15. Tout cela est possible dans le cœur animal, des cœurs humains intacts sont rarement disponibles. Par conséquent, un processus d’immersion qui permet pour la manipulation des échantillons de tissus obtenus dans la salle d’opération a été favorisé. Notre protocole de « 3-step » contient 3 separate incubation étapes à savoir lyse, solubilisation et l’enlèvement de l’ADN. Il donne humain ECM myocardique avec en grande partie préservé protéine et glycosaminoglycanes composition16,17. Ces tranches de cECM permettent des études in vitro des interactions cellule-matrice, mais sont mal adaptés pour des applications thérapeutiques potentielles de taille humaine. Le procédé de fabrication a été étendu ensuite pour produire des microparticules de cECM lyophilisée ou un hydrogel de cECM18.
Ce protocole permet la DÉCELLULARISATION du myocarde humain obtenu à partir des échantillons chirurgicales, préservant les principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) myocardique et leur activité biologique. Ce protocole est recommandé lorsque l’humain ECM cardiaque avec conserve bioactivité de tissu-spécifique est requis pour l’étude expérimentale des interactions cellule-matrice, ou lorsqu’un environnement adéquat est nécessaire pour des approches basées sur les cellules myocardiques régénération. En principe, il est également possible d’adapter ce protocole se rapportant à des conditions de qualité GMP, afin que l’utilisation de la cECM transformé devrait être faisables applications thérapeutiques à l’avenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de la préparation humaine ECM myocardique, l’objectif est de réaliser ce qui suit : enlèvement du matériel cellulaire immunogène pertinent, préservation de l’intégrité de l’ECM et la bioactivité, stérilité, absence de toxicité du produit fini, compatibilité GMP-process, et qualités du produit pour une application donnée en termes de manipulation. En combinant notre protocole DÉCELLULARISATION 3 étapes avec un traitement ultérieur dans des microparticules ou hydrogel auto-assemblage, matérie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki. Les patients fourni un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu à des fins de recherche, et le processus de prélèvement tissulaire a été approuvé par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de la Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
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