Обработка тканей человека сердца к внеклеточного матрикса самостоятельной сборки Гидрогель для In Vitro и In Vivo приложений
Summary
Этот протокол описывает полный decellularization человека миокарда при сохранении его компонентов внеклеточного матрикса. Дальнейшая обработка внеклеточная матрица результатов в производстве микрочастиц и цитопротективного самостоятельной сборки гидрогеля.
Abstract
Бесклеточной внеклеточного матрикса препараты являются полезными для изучения взаимодействия клеток матрица и облегчения применения терапии регенерации клеток. Ряд коммерческих внеклеточного матрикса продукты доступны как гидрогели или мембраны, но они не обладают биологической активности тканей конкретных. Потому что decellularization перфузии обычно не возможно с человеческой ткани сердца, мы разработали процесс погружения 3-шаг decellularization. Человека миокарда ломтиками, приобретенных во время операции сначала лечатся буфера lysis бесплатный стиральный порошок hyperosmolar, следуют инкубации с ионной стиральный порошок, лаурилсульфат натрия, и процесс завершится, используя встроенные DNase деятельность плода бычьим сывороточным. Этот метод приводит к листы клеток сердечной внеклеточной матрицы с во многом сохранились фиброзной ткани архитектуры и биополимерные состав, были продемонстрированы предоставлять конкретные экологические сигналы сердца клеточных популяций и плюрипотентных стволовых клетки. Сердца внеклеточного матрикса листов может затем быть далее перерабатывается в тонкодисперсный порошок без дальнейшей химической модификации, или, через краткосрочные пепсин пищеварение, в самостоятельной сборки сердца внеклеточного матрикса гидрогеля с консервированные биологическую.
Introduction
Внеклеточная матрица (ECM) обеспечивает не только структурной поддержки, но также имеет важное значение для биологических клеток и тканей функции1. В самом сердце ECM участвует в регуляции патофизиологические реакции например фиброз, воспаление, ангиогенез, cardiomyocyte сократительной функции и жизнеспособности и резидентов прогениторных клеток судьбы. В дополнение к его основных компонентов – волокнистые гликопротеинов, гликозаминогликанов и протеогликаны – он содержит целый ряд секретируемые факторов роста и цитокинов, мембранные везикулы, содержащие нуклеиновых кислот и белков2,3.
Недавно стало ясно, что бесклеточной ECM препараты не только бесценным для изучения взаимодействия клеток матрицы, но и для потенциальных терапевтических клеток-приложений на основе. В настоящее время широко признается важность обеспечения надлежащих условий для терапевтического клеточных продуктов или инженерии тканей. Были предприняты попытки объединить клеточных суспензий или активных соединений с определенными Биополимерное гидрогели4,5,6 или коктейлей белка выделяется клетками мышиных саркома (т.е. Matrigel, Geltrex) 7. Однако, бывший имеют ограниченные биологическую, последние являются проблематичными в процессах GMP-сорт, и оба не хватает биологическую ткань конкретных сердца ECM (СКВ)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization миокарда ранее выполнялись перфузии всего сердца через коронарные сосудистую14,15. Хотя это возможно в сердцах животных, нетронутым человеческие сердца редко доступны. Таким образом процесс погружения, который позволяет для обработки образцов тканей, полученных в операционной комнате было оказано. Наши «3-шаг» протокол содержит 3 отдельных инкубации шаги, а именно лизиса, солюбилизация и удаления ДНК. Он дает человека миокарда ECM с во многом сохранились белка и Глюкозаминогликан состав16,17. Эти фрагменты СКВ позволяют в vitro исследования взаимодействий клеток матрица, но плохо подходят для потенциальных человека масштабе терапевтического применения. Производственный процесс был затем продлен до производства лиофилизированный СКВ микрочастицы или СКВ гидрогеля18.
Этот протокол позволяет для decellularization человека миокарда, полученные из хирургической образцов, сохраняя основные компоненты и их биологическая активность миокарда внеклеточного матрикса (ECM). Этот протокол рекомендуется, когда человеческие сердца ECM с сохранившихся биологическую ткань конкретных требуется для экспериментальных исследований взаимодействия клеток матрицы, или когда подходящей среды необходима для подходов, основанных на клетки миокарда регенерации. В принципе возможна также адаптировать этот протокол в условиях GMP-класса, так что использование обработанных СКВ должно быть возможным в будущем терапевтического применения.
Protocol
Representative Results
Discussion
При подготовке человека миокарда ECM, цель – добиться следующее: удаление соответствующих иммуногенность клеточного материала, сохранение целостности ECM и биологическую, бесплодие, нетоксичность конечного продукта, GMP-процесса совместимости, и пригодность продукта для данного приложе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Протокол исследования соответствует этические принципы, изложенные в Хельсинкской декларации. Обоснованного согласия пациентов предусмотрено использование ткани для исследовательских целей, а процесс сбора ткани был одобрен институциональных Наблюдательный Совет и Комитет по этике Шарите – этот Berlin (ΕΑ4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
