Lavorazione di tessuto cardiaco umano verso la matrice extracellulare autoassemblanti idrogel per In Vitro e In Vivo applicazioni
Summary
Questo protocollo descrive la completa decellularizzazione di miocardio umano pur conservando le sue componenti della matrice extracellulare. Ulteriore elaborazione dei risultati nella produzione di microparticelle e un idrogel autoassemblanti cytoprotective matrice extracellulare.
Abstract
Matrice extracellulare acellulare preparazioni sono utili nello studio delle interazioni cellula-matrice e agevolare le domande di terapia rigenerativa delle cellule. Diversi prodotti commerciali di matrice extracellulare sono disponibili come idrogel o membrane, ma questi non possiedono attività biologica tessuto-specifica. Perché decellularizzazione di aspersione non è solitamente possibile con tessuto cardiaco umano, abbiamo sviluppato un processo di decellularizzazione immersione 3-passo. Fette del miocardio umani procurati durante la chirurgia vengono prima trattati con buffer di lisi di hyperosmolar privo di detergente, seguita da incubazione con il solfato dodecilico di sodio di detersivo, ionico, e il processo è completato, sfruttando l’attività intrinseca della dnasi di siero bovino fetale. Questa tecnica si traduce in fogli senza cellula di matrice extracellulare cardiaca con in gran parte conservata composizione architettura e biopolimero di tessuto fibroso, che sono stati indicati per fornire stimoli ambientali specifici per le popolazioni delle cellule cardiache e staminali pluripotenti indotte cellule. Matrice extracellulare cardiaco possono quindi essere ulteriormente trasformati in una polvere di microparticelle senza ulteriore modificazione chimica, o, attraverso la digestione pepsina a breve termine, in un auto-assemblanti idrogel di matrice extracellulare cardiaca con conservato bioattività.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) fornisce non solo il supporto strutturale, ma è importante anche per cellula biologica e tessuto funzione1. Nel cuore, l’ECM interviene nella regolazione delle risposte patofisiologiche come fibrosi, infiammazione, l’angiogenesi, la funzione contrattile del cardiomyocyte e attuabilità e destino delle cellule staminali e progenitori residenti. Oltre ai suoi componenti primari – fibrosi glicoproteine, glicosaminoglicani e proteoglicani – contiene una serie di fattori di crescita secreti, citochine e membranose vescicole contenenti acidi nucleici e proteine2,3.
Recentemente è diventato chiaro che acellulare preparazioni di ECM non sono solo inestimabile per lo studio delle interazioni cellula-matrice, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche basate sulle cellule. L’importanza di fornire un ambiente adeguato per prodotti terapeutici delle cellule o tessuti ingegnerizzati è ormai ampiamente riconosciuta. Tentativi sono stati fatti per combinare sospensioni cellulari o composti attivi definiti idrogeli biopolymeric4,5,6 o con cocktail di proteina secreta dalle cellule di sarcoma murino (cioè, Matrigel, Geltrex) 7. Tuttavia, l’ex hanno limitato la bioattività, quest’ultimo è problematico nei processi di GMP-grado ed entrambi mancano la bioattività di tessuto-specifica di cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularizzazione del miocardio è stata eseguita in precedenza da aspersione di tutto il cuore tramite le vene coronarie14,15. Mentre questo è possibile nei cuori degli animali, cuori umani intatti sono raramente disponibili. Di conseguenza, è stato favorito un processo di immersione che permette una gestione di campioni di tessuto ottenuti in sala operatoria. Il nostro protocollo “3-step” contiene 3 separato incubazione passi cioè Lisi, solubilizzazione e rimozione del DNA. Produce del miocardio umano ECM con16,in gran parte conservata della proteina e glicosaminoglicani composizione17. Queste fette cECM permettono per studi in vitro delle interazioni cellula-matrice, ma sono poco adatte per le potenziali applicazioni terapeutiche su scala umana. Il processo di fabbricazione è stato poi esteso per produrre microparticelle cECM liofilizzato o un cECM idrogel18.
Questo protocollo consente il decellularizzazione di miocardio umano ottenuto da campioni chirurgici, preservando i componenti principali del miocardio della matrice extracellulare (ECM) e la loro attività biologica. Questo protocollo è consigliato quando cardiaco umano ECM con conservato bioattività di tessuto-specifici è necessario per gli studi sperimentali delle interazioni cellula-matrice, o quando è necessario un ambiente adatto per gli approcci basati su cellule di rigenerazione miocardica. In linea di principio, è anche possibile adattare questo protocollo alle condizioni GMP-grado, così che l’uso di elaborati cECM dovrebbe essere fattibile applicazioni terapeutiche in futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la preparazione del miocardio umano ECM, l’obiettivo è quello di conseguire i seguenti obiettivi: rimozione di materiale cellulare immunogeno pertinente, conservazione dell’integrità di ECM e bioattività, sterilità, non-tossicità del prodotto finale, compatibilità GMP-processo, e idoneità del prodotto per una determinata applicazione in termini di gestione. Combinando il nostro protocollo di decellularizzazione 3-passaggio con ulteriore trasformazione in microparticelle o idrogel autoassemblanti, materiale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il protocollo di studio è conforme ai principi etici delineati nella dichiarazione di Helsinki. Pazienti hanno fornito il consenso informato per l’uso del tessuto per scopi di ricerca, e il processo di raccolta del tessuto è stato approvato dal comitato di etica della Charité – Universitätsmedizin Berlino (EA4/028/12) e Institutional Review Board.
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
