Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die komplette Decellularization des menschlichen Myokard unter Beibehaltung seiner Komponenten der extrazellulären Matrix. Weiterverarbeitung der extrazellulären Matrix Ergebnisse bei der Herstellung von Mikropartikeln und einer zellschützenden selbstorganisierende Hydrogel.
Abstract
Azellulärer extrazelluläre Matrix Präparate eignen sich für das Studium der Zellmatrix Interaktionen und regenerative Therapieanwendungen erleichtern. Einige kommerzielle extrazelluläre Matrix Produkte sind erhältlich als Hydrogele oder Membranen, aber diese besitzen keine Gewebe-spezifische biologischen Aktivität. Da Perfusion Decellularization in der Regel nicht mit menschlichen Herzgewebe möglich ist, haben wir einen 3-Stufen-eintauchen-Decellularization-Prozess entwickelt. Menschlichen myokardiale Scheiben beschafft während der Operation werden zunächst mit Waschmittel-freie Hyperosmolar Lyse Puffer, gefolgt von Inkubation mit ionischen Waschmittel, Sodium Dodecyl Sulfat behandelt und der Vorgang abgeschlossen ist, durch Ausnutzung der intrinsischen DNase-Aktivität des fetale Rinderserum. Diese Technik führt zu zellfreie Blätter der kardialen extrazelluläre Matrix mit weitgehend erhaltenen Bindegewebe Architektur und Biopolymer Zusammensetzung, die erwiesen sich als kardiale Zellpopulationen und pluripotenten Stammzellen bestimmte ökologische Hinweise anzubieten Zellen. Kardiale extrazelluläre Matrix Blätter können dann weiter verarbeitet zu einem Mikropartikel Pulver ohne weitere chemische Modifikation oder, über kurzfristige Pepsin Verdauung in einem selbstorganisierenden kardiale extrazelluläre Matrix Hydrogel mit erhalten Bioaktivität.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (ECM) bietet nicht nur strukturelle Unterstützung ist aber auch wichtig für biologische Zelle und Gewebe Funktion1. Im Herzen beteiligt sich das ECM bei der Regulierung der pathophysiologische Reaktionen wie Fibrose, Entzündungen, Angiogenese, Cardiomyocyte kontraktile Funktion und Lebensfähigkeit und resident Stammvater Zelle Schicksal. Es enthält neben seiner primären Komponenten – faserige Glykoproteine, Glykosaminoglykane und Proteoglykane – eine Vielzahl von sekretierten Wachstumsfaktoren, Zytokine und häutigen Vesikel mit Nukleinsäuren und Proteine,2,3.
Es kürzlich klar geworden, dass azelluläre ECM Vorbereitungen nicht nur für das Studium der Zellmatrix Interaktionen, aber auch für potentielle therapeutische Zell-basierte Anwendungen von unschätzbarem Wert sind. Die Bedeutung der Bereitstellung einer geeigneten Umgebung auf therapeutische Zelle Produkte oder technische Gewebe ist jetzt weithin anerkannt. Versuche wurden unternommen, Zellsuspensionen oder Wirkstoffe kombinieren mit definierten biopolymeric Hydrogele4,5,6 oder mit Protein Cocktails sezerniert murinen Sarkom Zellen (d. h. Matrigel, Geltrex) 7. Erstere haben begrenzte Bioaktivität, letztere sind jedoch problematisch in GMP-Klasse Prozesse, und beide fehlt die gewebespezifischen Bioaktivität von kardialen ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization der Herzmuskel wurde zuvor von Perfusion von ganzem Herzen über den koronaren Gefäßsystem14,15durchgeführt. Dies ist, zwar möglich in tierische Herzen sind intakte Menschenherzen nur selten zur Verfügung. Daher wurde ein Eintauchen-Prozess, für den Umgang mit Gewebeproben im OP-Saal ermöglicht, begünstigt. Unser “3-Step”-Protokoll enthält 3 Separate Inkubation Schritte, nämlich Lyse Solubilisierung und DNA-Entnahme. Es ergibt sich menschlichen myokardialen ECM mit weitgehend erhaltenen Protein und Glykosaminoglykan Zusammensetzung16,17. Diese cECM Scheiben für in-vitro- Studien der Zelle-Matrix Interaktionen ermöglichen aber sind schlecht für Menschen-Skala therapeutische Anwendungsmöglichkeiten geeignet. Der Herstellungsprozess wurde dann erweitert, um entweder lyophilisierten cECM Mikropartikel oder ein cECM Hydrogel18produzieren.
Dieses Protokoll ermöglicht die Decellularization des menschlichen Myokard von chirurgischen Proben, Erhaltung der Hauptkomponenten des myokardialen extrazelluläre Matrix (ECM) und deren biologische Aktivität erreicht. Dieses Protokoll wird empfohlen, wenn menschliche Herz ECM mit erhaltenen Gewebe-spezifische Bioaktivität für experimentelle Studien der Zelle-Matrix Interaktionen erforderlich ist oder wenn ein geeignetes Umfeld für zellbasierte Herzmuskelregeneration Ansätze benötigt wird. Im Prinzip ist es auch möglich, dieses Protokoll zum GMP-Klasse Bedingungen anzupassen, so dass die Verwendung von verarbeitetem cECM machbar in Zukunft therapeutisch sein sollte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beim menschlichen myokardialen ECM vorbereiten, das Ziel ist es, Folgendes zu erreichen: Entfernung von relevanten immunogen Zellmaterial, Erhaltung der Integrität von ECM und Bioaktivität, Sterilität, Ungiftigkeit des Endproduktes, GMP-Prozess Kompatibilität und Eignung des Produkts für eine bestimmte Anwendung in Bezug auf die Handhabung. Durch die Kombination unserer 3-Stufen-Decellularization-Protokoll mit Weiterverarbeitung zu Mikropartikeln oder selbstorganisierende Hydrogel, kardiale ECM Menschenmaterial ergi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Studienprotokoll passt sich an die ethischen Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki. Patienten zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung für die Verwendung des Gewebes um zu Forschungszwecken und der Prozess der Gewebe Sammlung von Institutional Review Board und Ethikkommission der Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) genehmigt wurde.
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
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