Bearbetning av mänskliga hjärtvävnad mot extracellulära Matrix självmonterande Hydrogel för In Vitro och In Vivo applikationer
Summary
Det här protokollet beskriver den kompletta decellularization av mänskliga hjärtmuskeln samtidigt bevara dess extracellulär matrix komponenter. Vidare bearbetning av extracellulärmatrix resulterar i produktion av mikropartiklar och en cytoprotektiva själv montering hydrogel.
Abstract
Acellulärt extracellulärmatrix preparat är användbara för att studera cell-matrix interaktioner och underlätta regenerativ cell terapi program. Flera kommersiella extracellulär matrix produkter finns som hydrogels eller membran, men dessa äger inte vävnadsspecifika biologisk aktivitet. Eftersom perfusion decellularization inte är oftast möjligt med mänskliga hjärtat vävnad, utvecklade vi en 3-stegs nedsänkning decellularization process. Mänskliga hjärtinfarkt skivor upphandlas under operation behandlas först med tvättmedel-fri hyperosmolär lyseringsbuffert, följt av inkubation med den joniska tvättmedel, sodium dodecyl sulfaten, och processen är klar genom att utnyttja den inneboende DNAS aktiviteten av fetalt bovint serum. Denna teknik resulterar i cellfria ark hjärt extracellulärmatrix med till stor del bevarade fibrös vävnad arkitektur och biopolymer sammansättning, som visades att tillhandahålla särskilda miljömässiga ledtrådar till hjärt cellpopulationer och pluripotenta stamceller celler. Hjärt extracellulärmatrix ark kan sedan ytterligare bearbetas till ett microparticle pulver utan ytterligare kemisk modifiering, eller, via kortsiktiga pepsin matsmältningen, in i en egen montering hjärt extracellulärmatrix hydrogel med bevarade bioaktivitet.
Introduction
Den extracellulära matrixen (ECM) ger inte bara strukturella stöd men är också viktigt för biologiska celler och vävnad fungerar1. I hjärtat deltar ECM i regleringen av patofysiologiska svaren som fibros, inflammation, angiogenes, hjärtmuskelcellen kontraktila funktion och lönsamhet och bosatt progenitor cell öde. Förutom dess primära komponenter – fibrösa glykoproteiner, glykosaminoglykaner och proteoglykaner – innehåller den en mängd utsöndras tillväxtfaktorer och cytokiner membranös blåsor som innehåller nukleinsyror och proteiner2,3.
Nyligen har det blivit klart att acellulära ECM preparat inte bara ovärderlig för att studera cell-matrix interaktioner, men också för potentiella terapeutiska cell-baserat program. Vikten av att tillhandahålla en adekvat miljö till terapeutisk cell produkter eller manipulerade vävnader är nu allmänt erkänt. Försök har gjorts att kombinera cellsuspensioner eller aktiva föreningar med definierade biopolymeric hydrogels4,5,6 eller med protein drinkar utsöndras av murina sarkom celler (dvs. Matrigel, Geltrex) 7. dock den tidigare har begränsat bioaktivitet, den senare är problematiska i GMP-grade processer och både saknar den vävnadsspecifika bioaktiviteten av hjärt ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization hjärtmuskeln har tidigare utförts av perfusionen i hela hjärtat via hjärt kärlsystemet14,15. Även detta är möjligt i djurens hjärtan, finns sällan intakt människors hjärtan. Därför gynnades en nedsänkning process som möjliggör hantering av vävnadsprover som erhållits i operationssalen. Vår ”3-steg”-protokollet innehåller 3 separata inkubation steg nämligen lysis, lösbarhet och DNA borttagning. Det ger mänskliga hjärtinfarkt ECM med till stor del bevarade protein och glykosaminoglykan sammansättning16,17. Dessa cECM skivor tillåta för in vitro- studier av cell-matrix interaktioner men lämpar sig dåligt för potentiell mänsklig skala terapeutiska tillämpningar. Tillverkningsprocessen utökades sedan till att producera antingen frystorkade cECM mikropartiklar eller en cECM hydrogel18.
Detta protokoll möjliggör decellularization av mänskliga hjärtmuskeln erhållits från kirurgiska prover, bevara de viktigaste komponenterna i hjärtinfarkt extracellulär matrix (ECM) och deras biologiska aktiviteten. Detta protokoll rekommenderas när mänskliga hjärt ECM med bevarade vävnadsspecifika bioaktivitet krävs för experimentella studier av cell-matrix interaktioner, eller när en lämplig miljö behövs för cellbaserade hjärtinfarkt förnyelse metoder. I princip är det också möjligt att anpassa detta protokoll till GMP-grade villkor, så att användning av bearbetade cECM bör vara möjligt i framtiden terapeutiska tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
När du förbereder mänskliga hjärtinfarkt ECM, målet är att uppnå följande: avlägsnande av relevanta immunogent cellulära material, bevarande av ECM integritet och bioaktivitet, sterilitet, icke-toxicitet av slutprodukten, GMP-processen kompatibilitet, och lämplighet för ett visst program när det gäller hantering. Genom att kombinera vår 3-stegs decellularization protokoll med ytterligare bearbetning till mikropartiklar eller egen montering hydrogel, humant hjärt ECM material erhålls som äger viss biolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studieprotokollet uppfyller de etiska principerna i Helsingforsdeklarationen. Patienter föreskrivs användning av vävnad för forskningsändamål informerat samtycke, och processen för vävnad samling godkändes av institutionella Review Board och etikkommitté Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
