Summary
높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.
Abstract
다양 한 방법 설명 림프 종 또는 lymphoproliferative 증후군 환자에서 NK/T 세포 라인을 설립 되었습니다. 이러한 방법을 피더 셀, 순화 NK / T 세포, 혈액 10 mL로 또는 일리노이-2 높은 복용량 사용. 이 연구는 재조합 인간 일리노이-2 (rhIL-2)의 추가 함께 주변을 경작 하 여 NK, T 세포 라인 혈액 단 세포 (PBMC)를 설정 하는 강력 하 고 간단한 전략으로 새로운 메서드를 제공 하 고 전체 혈액의 2 mL 만큼 약간 사용 합니다. 셀 2 주에 신속 하 게 증식 수 고 3 개월 이상 유지 됩니다. 이 방법으로 7 NK 또는 T 세포 라인 높은 성공율으로 설립 되었습니다. 이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 더 많은 경우의 CAEBV 또는 NK/T 세포 림프 종에서 셀 라인 구축에 적용.
Introduction
엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 유비 쿼터 스 이며 감염 B 셀 뿐만 아니라 T 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병 (LPD) 및 림프 종/백혈병, EBV 관련 hemophagocytic 등의 수는 lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme와 같은 림프 종, extranodal NK/T-세포 림프 종, 비 강 유형 및 호전적인 NK 세포 백혈병1,2,3. 이러한 가운데는 심각한 만성 활성 EBV (SCAEBV) 질병, 사고, 동남 아시아에서 주로 그리고 있는 지금 LPD EBV 감염 T 나 NK 세포4,,56, 의 클론 확장으로 인 한 것으로 간주 됩니다. 7, 하지만 명백한 면역 결핍 없이 전염 성 mononucleosis (IM)에 존재-처럼 높은 EBV DNA로 서 지속적으로 또는 recurrently, 발열, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, 및 간 기능 장애 등 증상에 로드는 말 초 혈액8,9. CAEBV 가진 환자는 빈약한 예 지10,11및 그것의 병 인 그리고는 EBV의 역할은 분명 하다. 따라서, EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병에서 파생 된 라인 세포 및 림프 종 백혈병의 발생률이 높은와 NK 또는 T 세포 확산 및 그것의 관계를 유도 EBV의 메커니즘을 명확히 셀 모델로 매우 도움이 또는 림프 종입니다.
날짜 하려면, 여러 셀 라인 다른 기법12,13,14,,1516함께 설립 되었습니다. 인간 NK 세포 선, NK-YS, NK 세포 림프 종/백혈병, 피더로 그리고 rhIL-2 mL15당 20U의 농도에서 존재 마우스 stromal 세포 라인 공동 경작에 의해 설립 되었다. KAI3 다른 NK 세포 선 심각한 모기 알레르기를 가진 환자 또는 헌 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL), SCAEBV에서 설립 되었다 B 세포 EBV, 피더 세포와 100U/mL16rhIL-2의 추가 변형. SNK6와 SNT8는 rhIL-2 (700U/mL)12의 높은 복용량을 추가 하 여 비 강 NK/T 세포 림프 종 환자 들의 종양 조직에서 파생 되었다. 유사한 기술, SNK-1 셀 CAEBV 환자, PBMC에서 T 세포를 제거 하 고 rhIL-213,17700U/mL을 추가 하 여 양식에서 했다. SNT13와 SNT15는 CD4 + 및 CD8 + 세포18제거 하 여 설립 되었다. 지금까지, EBV-NK/T LPD 환자에서 다른 T 세포와 NK 세포 선이 방법19모두 개발 되었다.
위에서 언급 한 기존 방법의 단점 때문에 병원에서 매우 도전적인는 일리노이-2로 10 mL 전 혈의 활용 또는 NK/T 세포의 정화의 높은 복용량의 요구 피더 세포의 고용 포함 어떤 종류의 세포는 EBV latently 확인의 필요성 문화 시작 하기 전에 감염. CAEBV 아시아 아이 들에서 주로 발생 10 mL 혈액 모든 지역에서 얻기 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 피더 세포 없이 rhIL2의 낮은 복용량과 전체 혈액의 2 mL의 볼륨을 사용 하 여 CAEBV 환자에서 PBMC를 경작 NK / T 세포 라인을 구축 하 고 성공률을 새로운 간단한 방법을 개발. 이 방법의 결과 그것의 높은 효율성과 시간 절약을 입증 했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 연구소의 유전학 그리고 개발 생물학, 과학의 중국 아카데미의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 프로토콜 인간의 복지에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.
참고: 워크플로 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
1입니다. CAEBV 환자에서 PBMC의 격리
- 그라데이션 (예를 들어, Ficoll-패)에 의해 CAEBV 환자의 전체 혈액의 2 mL에서 기본 PBMC 정화 제조업체의 지침에 따라 원심 분리. 또는, 해빙 RPMI 1640 매체 액체 질소에서 PBMC를 cryopreserved.
- 18 µ L 세포 현 탁 액에 2 µ L trypan 블루의 (0.4%)를 추가, 얼룩 셀, 셀 카운터 접시에 정지를 전송 및 세포의 농도 자동된 셀 카운터 생존 능력을 측정 3 분 기다려야 합니다.
- 2-3 × 106 셀/mL 20% 인간의 혈 청 (56 ° C에서 비활성화 열), 2 m L-글루타민, m을 포함 하는 완전 한 RPMI 1640 문화 매체와 보충의 조밀도에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 항생제 (100 µ g/mL 스, 100 U/mL 페니실린). 씨 24-잘 세포 배양 배지로 잘 당 PBMC 서 스 펜 션의 1 mL.
- 잘 당 150 U rhIL-2를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 배양 배지를 배치
- 하루에 2, 현미경 (200 배 확대); 세포 형태 관찰 셀은 밝고 라운드 때 좋은 상태에 있습니다.
2. 확장 셀의 가능한 셀 번호 매기기
- (200 배 확대), 현미경으로 세포 형태를 관찰 하 고 매체를 변경 하기 전에 셀 번호 매기기에 의해 세포 성장 상태를 모니터링: 18 µ L 세포 현 탁 액을 trypan 블루 (0.4%)의 2 µ L을 추가 하 고 세포의 농도 계산 (1.2 참조 그림 2).
- 24-잘 접시에 매체의 500 µ L를 무시 하 고 500 µ L 신선한 완전 한 문화 매체를 추가 합니다. 잘 당 150U rhIL-2를 추가 합니다.
- 중간 단계 2.2에서 일주일에 두 번 변경 합니다.
- 세포 성장 곡선 (그림 3)를 그립니다.
- 실행 가능한 세포의 농도 5 × 106/mL을 초과 하면 1-2 × 106 셀/mL에 각 잘의 농도에 새로운 우물으로 셀을 나눕니다. 이 프로세스는 2-4 주 걸립니다.
3. 세포 형질 Cytometry에 의해
- 세포는 확장 하는 때, 결정 셀 라인의 고기를 1 × 106 세포를 수집 합니다. 실 온에서 5 분 동안 240 x g 에서 세포를 원심 (NK/T 세포는 튜브의 밑에 침전 것 이다).
- 상쾌한, 7 mL PBS를 추가 하 여 강수량을 세척. 실 온에서 240 x g 에 5 분 동안 원심 분리기. 한 번 반복 합니다.
- 각 튜브를 200 µ L 인간의 혈 청을 추가 하 고 잘 섞어 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 실 온에서 5 분 동안 240 x g에서 셀 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시 1 × 106/mL 찬 PBSA (PBS+0.2%BSA)에서 세포를 일시 중지. 2 × 105 셀을 포함 하는 각 관 5 튜브로 셀을 나눕니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 240 x g에서 원심 분리기 세포 상쾌한 삭제 하 고 다시 PBSA 버퍼 또는 PBSA 10 µ L PE (또는 PE-Cy7)를 포함 하는 셀을 일시 중지와 10 µ L FITC 표시 그림 4에 의해 나타나는 것과 같이 얼음 T 나 NK 세포의 세포 수용 체를 얼룩에 항 체. 셀 PBSA 버퍼 중단 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
- 어둠 속에서 얼음에 20-30 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어.
- 씻어 감기 PBSA 두 번 셀, 다시 셀 300 µ L 중단 차가운 PBSA.
- 와 교류 cytometer 세포 표현 형 분석.
- Flow Cytometer 조건 "워크시트 만들기"에 설정 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)를 표시 하는 도트 음모와 실험 서식 파일을 설정 합니다.
- FSC 그리고 SSC 전압 최적화 isotype 제어 튜브를 로드 하 고 관심의 세포 인구를 방해 하지 않고 파편을 제거 하기 위해 FSC 임계값 값 최적화. FSC, SSC, FITC, PE PE Cy7를 제외한 모든 매개 변수를 삭제 합니다.
- 각 2 색 분석 그룹에 isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 보정을 수행 합니다.
- 샘플을 로드 HLA-DR VS CD19, CD56 VS CD16, CD4 VS CD8, CD3 VS CD16 점 세포의 다른 인구를 보여주는 플롯 이다.
참고: PBMC 보상 제외/isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 수행할 수 사용 되었다. 교류 cytometer와 2 색 면역 형광 표면 마커 표현 분석을 정기적으로 사용 되었다. 다음 항 체가 포함 되어 있습니다: 안티-HLA-DR, 안티-CD4, 안티-CD16 fluorescein isothiocyanate (FITC), 안티-CD8, 안티 CD56 활용, CD3 phycoerythrin (PE)와 활용 및 안티-CD19 PE Cy7와 활용.
4. 확장 및 Cryopreservation NK/T 세포의
- 세포 표현 형 분석을 완료 하는 때 매체를 변경 합니다. 신중 하 게는 상쾌한의 절반을 제거 하 고 접시의 바닥에 세포를 만지지 마십시오. 포함 된 셀 판 300 U/mL rhIL-2 신선한 문화 매체의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
- 매체의 절반을 변경 셀까지 (2.2)로 3 일 마다 클러스터 현미경 (그림 2) 명확 하 게 볼 수 있습니다. 일반적으로이 프로세스는 2-3 주 걸립니다.
- 같은 혈통의 다른 우물을 혼합 후 24-잘 접시에서 T25 문화 플라스 크 셀을 전송. 문화 매체의 볼륨 두 매체의 볼륨까지 노란색으로 10-15 mL을 확장 합니다. RhIL-150 U/mL의 농도와 2를 추가 합니다.
- 성장, 2-3 주 후 냉동 하기 전에 중간 24 h를 변경 하면 셀 질량 육안으로 관찰 될 수 있다. 셀 카운터로 세포 농도 측정 합니다.
- 240 x g에 5 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 하 고 다시 5-10 배 90% 태아 둔감 한 혈 청 및 10 %dimethylsulfoxide (DMSO)를 포함 하는 냉동 재고 솔루션 106 셀/mL의 조밀도에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. -80 ° C에 분 당 1 ° C의 속도로 십시오 그리고 그 후 액체 질소에 직접 전송.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
후에 3 일 셀 라인의 설립 동안 문화, 다형성 세포 나타납니다 (그림 2)를 시작 합니다. 7 일 후 세포 수와 세포의 생존 능력 (그림 3) 높은 속도로 증가 신속 하 게, 성장. 셀의 작은 클러스터 셀 농도 3-6 × 106을 초과할 수 있습니다 때, 성장 하는 10-14 일 후 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 기간에 문화 접시 2 개 또는 3 개의 우물에 사단에 의해 세포를 확장 한다. 약 한 달 후, 한 번 셀 숫자에 도달 3-5 × 107, 개수는 보존을 위한 충분히 높은.
또 다른 중요 한 문제 셀 성공적으로 경작 되는 때에 고기를 결정 하는. 우리의 결과 셀 좋은 조건에서 3 개월 이상 성장 T (L196)와 NK (M296) 세포 (그림 4), 위에서 설명한 방법으로 경작 될 수 있습니다 및 셀 라인이이 기법으로 설립 될 수를 나타냅니다.
그림 1: 워크플로의 도식 대표. 첫 날, 혈액 항 응 혈 약 그리고 PBMC 했다 분리 20% 인간의 혈 청 및 150U/mL rhIL 2의 포함 된 1640 매체와 경작 CAEBV 환자에서 수집 되었다. NK/T 세포는 5% CO2의 37 ° C에서 성장 했다. 2-4 주 후 배양, 세포는 빠르게 성장 하기 시작 했다. 농도 5 × 106 /mL을 초과 하는 때 우리가 나눌 셀 2 × 106의 농도에서 2-3 웰 스. 2-3 주에 대 한 문화를 계속, 셀으로 옮겨 졌다 24-잘 접시에서 T25 플라스 크 셀 클러스터 현미경 명확 하 게 볼 수 있었다. Cryopreserve 때 세포는 세포 질량 육안으로 관찰 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 경작 하는 과정에서 세포질 형태학 변화. 셀은 경작 하 고 일의 지정 된 번호에 대 한 관찰. 다형 셀 (지적 화살표) 3-7 일 후에 명확 하 게 현미경 아래에서 볼 수 있었고 셀 7-14 일 문화 후 빠르게 성장 하기 시작 했다. 가벼운 현미경 검사 법에 대 한 원래 배율 200 X 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 세포 증식의 성장 곡선. 7 일 배양 후 셀 (A) 신속 하 게 성장 하기 시작 했다와 높은 생존 능력 (B). 세포의 농도 생존 다음 절차는 자동화 된 셀 카운터로 측정 되었다: 얼룩에 대 한 셀 서 스 펜 션의 18 µ L을 trypan 블루 (0.4%)의 2 µ L를 추가, 3 분을 기다릴, 셀 카운터 접시에 정지를 전송 및 측정 셀 농도 그리고 자동화 된 셀 카운터와 세포 생존 능력. 오차 막대는 3 개의 복제본의 표준 편차. L196, Z290, M296, L311는 4 개의 셀 라인의 이름입니다. 성장 곡선을 측정 하기 시작 농도 약 3 × 106입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: L196 및 M296 셀 라인의 흐름 cytometry 분석에 대 한 전략을 게이팅 대표. PBMC는 FSC 그리고 SSC 전압을 조정 하기 위해 사용 되었다. 라이브와 단일 세포의 클러스터는 FSC 그리고 SSC 플롯에서 p 1에 대 한 문이 되었다. Isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤 보상을 수행 하기 위해 사용 되었다. 4 쌍의 활용 2-컬러 면역 형광 항 체 염색 표면 마커의 식을 분석 하 사용 되었다. 안티-CD3, 안티-CD4, 및 안티-CD8 T 세포를 감지 하는 데 사용 했다 반면 안티-HLA-DR 및 안티 CD19 B 셀을 검출 사용 되었다. 안티-CD16와 안티 CD56 NK 세포를 정의 하기 위해 사용 되었다. (A) L196의 표현 형이 CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, 주요 셀 형식 이다 CD8 +. (B) M296는 CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, 주요 셀 형식이 CD16 + CD56 +. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서 CAEBV 환자의 전체 혈액에서 NK/T 세포 라인을 설립 하는 새로운 기술 개발 되었습니다. 기존의 방법에 비해,이 방법의 주요 장점은 그것의 단순 하 고 작은 양의 혈액의 그것의 필요 조건 그것은 세포 생존 능력의 좋은 조건과 높은 성공률을 전시 하는 동안. 게다가, NK/T 세포 라인 셀 형식 결정으로 사전에 감염 latently EBV 소비 더 많은 혈액과 경작 하기 전에 시간을 확인 하지 않고 PBMC를 경작 하 여 설정할 수 있습니다. 또는 셀 라인 분석 될 수 있다 하 고 세포의 다른 고기 셀 라인 설립 후 cytometry로 순화 될 수 있다. 게다가, 메서드 rhIL 2의 낮은 복용량을 사용 하 고 지류 셀 필요. 이 방법으로 우리 8 CAEBV 환자에서 7 셀 라인을 개발 하 고 한 달 이내에 그들을 cryopreserved. 하나는 셀 라인으로 개발 되지 않았습니다 중요 한 확산 없이 5 개월 이상 살아 유지 될 수 있다 그리고이 뒤에 이유 필요 추가 탐사.
그것은 세포 성장은 재조합 인간 일리노이-2, 이전 보고서20,21;와 일치 하는의 존재에 엄격 하 게 의존 하는 데 필요한 아니 인간의 일리노이-2와 셀은 3 주에 죽을 것 이다. 결국, 일리노이-2의 높은 품질은 체 외에서 세포의 증식 능력을 결정 하는 요소는 여전히 명백 하 게 할 필요 하지만 세포 증식, 필수적입니다. 일리노이-2 필요한 복용량은 다른 세포 사이에서 변수, 예를 들어, 50U/mL M296의 확산을 유지 하기 위해 만족 스러운. 그러나, NK/T 세포 라인을 설정 하기 위한 가장 경제적이 고 신뢰할 수 있는 농도 제시 되지 연구; 실제로, 150 U/mL은 성공을 위한 충분 합니다.
세포 배양, 세포 성장에 영향을 미치는 요소는이 과정에서 기본 PBMC의 생존 능력은 가장 중요 합니다. 성공을 위해는 PBMC 가능한 신선 해야 합니다. 의심의 여지가, 셀 농도 성공적인 경작에 영향을 미치는 중요 한 요소 이다, 따라서 임계값 값 10 보다 더 낮은5 mL 당. 샘플에서 고립 된 총 셀 수는 10 보다 작은 경우6, 적절 한 세포 농도 유지 하기 위해 미니 잘 셀 접시를 사용 하 여 초기 문화에 대안 선택입니다. 또한, NK, T 세포 라인 hemolytic 반응 우리가 보고 이전22PBMC를 풍부 하 게 사용 하는 경우는 제한 된 양의 주변 혈액으로 수립 될 수 있습니다. 프로토콜에 설명 된 대로 인간의 혈 청 문화의 시작 부분에서 세포 생존에 대 한 또 다른 핵심 요소입니다. 우리는 몇 가지 알 수 없는 재료는 결 석 하거나 소 태아 혈 청에서 다른 T/NK 세포 증식에 필요한 혈 청에 존재 한다는 추측.
방법의 두 가지 제한이 있습니다. 첫째,이 방법에 대 한 몇 가지 의문점이 같은 있다 vivo에서NK/T 세포 성장과 확산에는 생체 외에서의 메커니즘, 수 있는 셀의 유형 세포 EBV 감염 NK / T 어떻게 그리고 왜에 셀 라인으로 설립 한 환자입니다. 셀 유형 및 순수성, 방법에 의해 결정 되지 않습니다, 우리가 통제 하지 수 있지만 이러한 요소 EBV 감염 환자에서 셀에 종속 될 수도 있습니다. 이 방법은 한 종류를 우선적으로 문화 하지 수 있습니다. 있지만이 프로토콜 NK, T 세포, 셀 라인으로 설립 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 세포의 지배적인 그룹이입니다. 둘째, 거기 LPD 환자에서 NK, T 세포 클론 보고서 또는 다른 몇 개월17유지 될 수 있는 반면 NK/T 림프 종 세포 라인을 설립 될 수 있습니다. 그러나 셀 존재 연구에서 얻은 3 개월 넘는 증식 수, 여부 그들은 수 증식 무기한 유효성 검사 필요 합니다.
요약 하자면,이 방법을 사용 하 여 CAEBV 또는 NK/T 림프 종에서 더 많은 셀 라인은 제한 된 양의 피와는 낮은 복용량 일리노이-2의 피더 세포 없이 쉽게 얻을 수 있습니다. 이러한 셀 라인 NK/T 세포에서 EBV 지 속성의 연구에 기여할 것입니다 및 EBV의 병 인 백혈병 또는 림프 종.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.Z., X.Z., 및 X.C.에 NK/T 세포 선 및 연구에서 설립 셀 라인을 설정 하기 위한이 방법의 잠재적인 사용을 포함 하는 특허 출원의 공동 발명가. D.Z., X.Z., 및 X.C.는이 작품에서 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 나머지 작가 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품에서 중국의 국립 과학 재단 (전략적 생물 자원 기술 지원 시스템의 중국 과학 아카데미 (CZBZX-1, ZSSB-004) (KFZD-남서-205), 과학의 중국 아카데미 키 프로젝트 및 교부 금에 의해 지원 되었다 81401640) 자연 과학 기금 (14ZR1434800)을 상해 하 고.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I.
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E.
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
