פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.
Abstract
אצל יונקים, תאים שיער mechanosensory המאפשרים שמיעה חוסר היכולת להתחדש, אשר מוגבל טיפולים עבור אובדן שמיעה. אסטרטגיות רפואה רגנרטיבית הנוכחי התמקדו משתילים בתאי גזע או מניפולציה גנטית של סביב תמיכה התאים באוזן הפנימית כדי לעודד החלפה של תאים פגומים גזע כדי לתקן אובדן שמיעה. ובכל זאת, מטריצות (ECM) עשוי לשחק תפקיד חיוני גרימת ושמירה על תפקוד של תאים שיער, לא נבדקה היטב. באמצעות את שבלולי ECM בדומה לפיגום לגדל תאי גזע בוגרים עשויים לספק תובנות ייחודיות איך הרכב ואת הארכיטקטורה של הסביבה חוץ-תאית מסייע תאים הסדירה פונקציה השמיעה. כאן אנו מציגים שיטה אנליטית, decellularizing cochleae של עכברים להשתמש פיגומים מקבל תאי גזע בוגרים perfused. בפרוטוקול הנוכחי, cochleae הם בודדו אותנו מהמתרחש עכברים לאללה, decellularized, decalcified. לאחר מכן, תאים ג’לי האנושי וורטון (hWJCs) הם בודדו אותנו מהמתרחש הטבור היו perfused בזהירות לתוך כל שבלול. Cochleae שימשו ריאקטורים, התאים היו תרבותי עבור 30 ימים לפני שעברו עיבוד לניתוח. Decellularized cochleae נשמרות לזיהוי מבנים חוץ-תאית, אך אינו חושף את הנוכחות של תאים או מורגש שברי DNA. התאים perfused לתוך שבלול פלשו רוב הפנים והחוץ של שבלול, גדלה ללא תקלות משך זמן של 30 ימים. לכן, השיטה הנוכחית ניתן ללמוד איך שבלולי ECM משפיע על התא התפתחות והתנהגות.
Introduction
שבלול הוא מבנה לולייני המורכב נמצאו הרקה. הוא מורכב של המבוך הגרמי החיצוני ואת המבוך membranous קונצנטריים, פנימית1. המבוך membranous מורכב 3 משבצות נוזלים: סקאלה vestibuli, סקאלה מדיה, ו טימפני סקאלה1. התקשורת סקאלה בתים האפיתל חושית, המורכב משילוב של מספר רב של סוגי תאים, אך התאים שיער חושית (HC), אשר מגלי אנרגיה מכנית של גלי קול דחפים עצביים2, הם מעניינים במיוחד. חשיפה טראומה אקוסטית3,4,5, תרופות6,7,המחלה8והזדקנות9 כל יכול לגרום תפקוד לקוי השמיעה דרך המוות HC. איבוד תאים שיער אצל יונקים הוא קבע, בניגוד HCs העופות, אשר יכול להתחדש לאחר פציעה10.
מגוון רחב של מאמצי מחקר עכשווי ביקשו לשחזר HCs אבוד, אף הגישות ניסיוני ספציפיים משתנים. מניפולציה של ביטוי גנים בתוך האפיתל חושית, השתלה של תאי גזע הבדיל מחוץ לגוף הם גישות דומיננטי בתחום, למרות שיטות אינדוקציה שואפים להבדיל תאי גזע לתוך שבלולי organoids היה ניסיון11,12,13. כל הגישות הללו הוא גם מסתמך ישירות על תאי גזע, או התפתחותית הותאם בשימוש בתאי גזע; עם זאת, רגע משותף, שעשוי להיות קריטי, אלמנט זה ה-ECM של שבלול עצמו14,15.
ECM לא רק מספק תמיכה פיזית תאים ורקמות, אשר כולל משטח אדהזיה תא, התפשטות, הישרדות של ההעברה, אך גם ממלא תפקידים חיוניים להתפתחות HCs ומן ספירלה גנגליון15,16 ,17. באופן טבעי ECM המתרחשים מספק אותות אינדוקטיבית להנחות תא בנחישות פנוטיפ ו/או תא אדהזיה התפשטות, הישרדות18. כתוצאה מכך, השימוש של שבלול decellularized בשילוב עם hWJCs בתרבית מציעים הזדמנות ייחודית לגלות את התפקיד של התחדשות ECM ו- HC. HWJCs הם סוג זמינים, נתינת תא מבודד מן האדם חוטי חבל הטבור המתנהגים כמו גזע mesenchymal19. HWJCs הראו את היכולת להבחין תא neurosensory שושלות20,21. לפיכך, בפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד, decellularization ו זלוף של cochleae מ- C57BL הגוויות עכבר עם hWJCs עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהצלחה הראו כי ניתן להסיר תאים שבלולי יליד שבלול באמצעות תהליך decellularization, מה שמאפשר עבור השימוש של שבלול לגרדום רקמות מורכבות, תלת מימדי. סנטי ואח. 15 פיתח את שיטת הראשוני עבור decellularizing cochleae, במדויק העריכו את אמצעי האחסון של מבנים רבים-שבלולי דרך בעזרת מיקרוסקופ אור גיליון<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט הנוכחי מומן על ידי אוניברסיטת קנזס הוכחת הרעיון קרן. ברצוננו להודות. האחיות-KUMC (קנזס סיטי, קאי אס) עבור מסייע לנו בהשגת האנושי חבל הטבור חוטי יורגנסן דוד על סיוע עם תרבויות cochleae.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
