Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno
Summary
El objetivo de este protocolo es un método eficaz para decellularize y descalcificar cócleas de ratón para utilización como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
Abstract
En los mamíferos, las células de pelo de mechanosensory que facilitan la falta de audiencia la capacidad de regenerar, que ha limitado los tratamientos para la pérdida auditiva. Estrategias actuales de la medicina regenerativa se han centrado en el trasplante de células madre o la manipulación genética de células de apoyo en el oído interno para estimular la sustitución de células dañadas para corregir la pérdida de la audición de alrededor. Sin embargo, la matriz extracelular (ECM) puede jugar un papel vital en inducir y mantener la función de las células de pelo y no ha sido bien investigada. Usando el coclear ECM como un andamio para cultivar células madre adultas puede proporcionar perspectivas únicas en cómo la composición y la arquitectura del entorno extracelular ayuda a las células en el mantenimiento de la función auditiva. Aquí presentamos un método para aislar y decellularizing cócleas de ratones para usar como andamios aceptar perfusión células madre adultas. En el actual protocolo, cócleas son aislados de ratones eutanasia, decellularized y descalcificada. Después, celdas de jalea de Wharton humana (hWJCs) que fueron aisladas de cordón umbilical fueron perfundidas con cuidado en cada cóclea. Las cócleas fueron utilizados como Biorreactores, y las células fueron cultivadas durante 30 días antes de someterse a tratamiento para el análisis. Decellularized cócleas conservan estructuras extracelulares identificables, pero no reveló la presencia de células o notables fragmentos de ADN. Perfundidos en la cóclea las células invadieron la mayor parte del interior y el exterior de la cóclea y crecieron sin incidentes con una duración de 30 días. Así, el método actual que puede utilizarse para estudiar cómo coclear ECM afecta desarrollo de las células y comportamiento.
Introduction
La cóclea es una estructura intrincada espiral encontrada en el hueso temporal. Se compone de un exterior laberinto óseo y laberinto membranoso concéntricos, interior1. El laberinto membranoso consta de tres espacios fluidos: vestibuli de Scala, Scala tympani de Scala1y medios. Los medios del scala alberga el epitelio sensorial, que se compone de una multitud de tipos celulares, pero las células de pelo sensoriales (HC), que transduce la energía mecánica de las ondas sonoras a impulsos nerviosos2, son de particular interés. Exposición a trauma acústico3,4,5, medicamento6, enfermedad7,8y9 de envejecimiento puede resultar en deterioro de la función auditivo por medio de la muerte HC. Pérdida de células ciliadas en los mamíferos es permanente, a diferencia de HCs aviares, que pueden regenerar después de lesión10.
Una variedad de esfuerzos de investigación han intentado restablecer perdidos HCs, aunque varían los enfoques experimentales específicos. Manipulación de expresión génica en el epitelio sensorial y la implantación de células diferenciadas fuera del cuerpo son los enfoques dominantes en el campo, aunque han sido métodos de inducción que buscan diferenciar células madre en organoides coclear trató de11,12,13. Cada uno de estos enfoques es dependiente directamente de las células madre o las claves del desarrollo utilizadas por las células de vástago; sin embargo, un segundo compartido y potencialmente crítico, elemento es el ECM de la cóclea se14,15.
El ECM no sólo proporciona soporte físico para las células y tejidos, que incluye una superficie para la adhesión celular, proliferación, supervivencia y migración, pero también juega un papel crítico en el desarrollo de HCs y la espiral del ganglio15,16 ,17. Naturalmente ECM que ofrece señales inductivas que pueden guiar la determinación de fenotipo celular o de adhesión, proliferación y supervivencia de la célula18. En consecuencia, el uso de la cóclea decellularized en combinación con hWJCs cultivadas ofrecen una oportunidad única para explorar el papel de la regeneración de ECM y HC. HWJCs son un tipo de disponible, no controvertida de la célula aislado de humanos los cordones umbilicales que se comportan como células madre mesenquimales19. HWJCs han demostrado la capacidad de diferenciarse hacia abajo célula neurosensorial linajes20,21. Así, el protocolo actual detalla el aislamiento, la descelularización y perfusión de cócleas de canales de ratón C57BL con hWJCs para ingeniería de tejidos del oído interno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con éxito hemos demostrado que las células cocleares nativas pueden extraerse de la cóclea a través de un proceso de descelularización, que permite el uso de la cóclea como un andamio de tejido intrincado, tridimensional. Santi et al. 15 desarrolló el método inicial para cócleas decellularizing y con precisión se han estimado los volúmenes de muchas estructuras cocleares a través con la ayuda de microscopia de luz hoja23. Estos primeros trabajos sirvier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto fue financiado por la Universidad de Kansas Prueba de concepto de fondo. Nos gustaría agradecer al personal de enfermería en el KUMC (Kansas City, KS) para asistirnos en la obtención de cordones umbilicales humanos y David Jorgensen para ayudar con las culturas de cócleas.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
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