内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル
Summary
このプロトコルの目的は、decellularize し、めしマウス蝸牛組織工学用の足場として利用する効果的な方法を示すことです。
Abstract
哺乳類のヒアリング不足を再生する能力を促進する機械刺激受容の有毛細胞では、難聴の治療法を限られています。現在の再生医療戦略は、移植幹細胞や内耳難聴を修正する損傷した幹細胞の交換を奨励するためにサポート細胞を周囲の遺伝子操作に焦点を当てています。しかし、細胞外マトリックス (ECM) は誘導と有毛細胞の機能を維持する重要な役割を果たすこと、十分に調査されていません。人工内耳を使用して成体幹細胞を成長する足場として ECM 方法、組成と細胞外の環境のアーキテクチャにエイズ聴覚機能の維持の細胞に独特な洞察力があります。分離し、成体幹細胞灌流を受け入れる足場として使用するマウスからの蝸牛を decellularizing する方法をご紹介します。現在のプロトコルの蝸牛は安楽死させたマウス、脱と脱灰から分離されます。その後、臍帯から隔離された人間の Wharton のゼリー細胞 (hWJCs) は、各蝸牛に慎重に灌。バイオリアクター, として、蝸牛を用い、解析の処理を受ける前に 30 日間培養します。脱の蝸牛は個人の細胞外構造を保持が、細胞の存在や DNA の顕著なフラグメントを明らかにしなかった。蝸牛に灌流セルは蝸牛の内外面のほとんどを侵略し、30 日間の期間にわたって問題なく育った。したがって、どのように人工内耳の ECM の影響細胞発達や行動を研究する現在のメソッドを使用することができます。
Introduction
蝸牛は、側頭骨は、複雑なスパイラル構造です。外側の骨迷路と、同心の内側の膜迷路1から成り立っています。膜迷路は、流体の 3 つのスペースで構成されています: Scala スカラー座 vestibuli メディア、およびスカラー座索1。Scala メディア住宅感覚の上皮細胞の種類の多数で構成されているが、感覚有毛細胞 (HC)、神経インパルス2音波の機械的エネルギーを変換、特に重要です。音響外傷3,4、5薬6疾患7,8、および高齢化9への暴露は、すべての HC の死を介して聴覚機能障害で起因できます。哺乳類の毛細胞損失は傷害10後再生することができます鳥の HCs とは異なり、永続的なです。
様々 な現代的な研究努力を失われた HCs を復元する特定の実験的アプローチは異なるが求めています。感覚上皮における遺伝子発現の操作と体の外分化した幹細胞の注入、支配的なアプローチにおいて、蝸牛オルガノイドの幹細胞の分化を誘導方法がされているが11,12,13を試みた。それぞれのアプローチは、直接幹細胞や幹細胞の発達の手がかりに依存ただし、2 番目は共有で、潜在的に重要な要素はそれ自体蝸牛の ECM14,15。
ECM だけでなく細胞と細胞の接着、増殖、生存、および移行の面を含んでいますが、また HCs やらせん神経節報15,16 の開発に重要な役割を果たしている組織の物理的なサポートを提供します ,17。自然発生する ECM は、細胞の表現型決定および/または細胞の接着・増殖・生存の18のガイドが誘導信号を提供します。その結果、脱蝸牛培養 hWJCs との組み合わせでの使用は、ECM と HC の再生の役割を探検するユニークな機会を提供しています。HWJCs は、間葉系幹細胞の19のように振る舞うひと臍帯由来容易に利用できる、非論争の携帯タイプです。HWJCs は、麻痺細胞系統20,21を区別する能力を示しています。したがって、現在のプロトコル詳細分離、decellularization、および内耳組織工学用 hWJCs と C57BL マウスの死骸から蝸牛の血流を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は正常に蝸牛の複雑な三次元組織足場としての使用を可能にする decellularization プロセスを介して蝸牛からネイティブ蝸牛細胞を削除できることを実証しました。サンティら。15 decellularizing の蝸牛の最初のメソッドを開発し、光シート顕微鏡23の助けを借りてを通じて多くの人工内耳構造のボリュームを正確に推定しています。このような初期?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
現在のプロジェクトは、概念資金のカンザス大学証明書によって賄われていた。我々 感謝したい看護スタッフ院長 (カンザスシティ、カンザス) で取得の蝸牛文化を支援するためひと臍帯やデビッド ・ ヨルゲンセンのことで私たちを支援のため。
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
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