渗透胁迫对分泌性囊泡和胞吐作用的监测作用
Summary
渗透胁迫影响胞吐作用和在这个过程中释放的神经递质的数量。我们演示了如何结合电化学方法和透射电子显微术来研究细胞外渗透压对胞吐作用活性、囊泡量子大小和释放神经递质的影响。在胞吐作用期间。
Abstract
探头对渗透休克细胞的记录表明, 分泌细胞通过减少单个胞吐作用事件中的胞吐作用活性和囊泡释放的神经递质的数量来应对这一生理压力。有人建议, 减少神经递质的降低是由于细胞膜生物物理性质的变化, 当细胞收缩反应渗透胁迫, 并假设, 分泌泡在细胞胞浆不受影响细胞外渗透应力。探头记录胞吐作用监视器当囊泡与等离子膜融合时, 从细胞中释放出的是什么, 但在触发囊泡聚变之前没有提供有关囊泡含量的信息。因此, 通过结合探头记录与其他补充分析方法, 能够表征分泌囊泡在胞吐作用细胞被触发提供了一个更广泛的概述, 以检查如何分泌囊泡和胞吐作用过程受渗透冲击的影响。我们在这里描述如何补充探头记录与细胞内电化学细胞术和透射电镜 (TEM) 成像可以用来表征变化的分泌囊泡大小和神经递质的内容在嗜细胞与胞吐作用活性有关, 暴露于渗透胁迫前后。通过将从实验中获得的定量信息与所有三种分析方法联系起来, 得出结论: 分泌性囊泡通过缩小大小和减少囊泡量子大小来响应胞外渗透应力, 以保持一个恒定的囊泡神经递质浓度。因此, 这给出了一些解释, 为什么囊泡, 响应渗透应激, 减少释放的神经递质胞吐作用释放。这里的安培记录表明这是一个可逆的过程, 当被放置的细胞恢复到一个等质环境中时, 渗透休克后的囊泡会重新注入神经传递素。
Introduction
肾上腺中的嗜细胞是神经内分泌细胞, 释放神经递质分子进入血流。这是通过一个细胞过程, 其中包括对接和融合的神经递质囊泡, 导致内容释放从囊泡到细胞外空间的过程称为胞吐作用。嗜细胞中的神经递质 (肾上腺素和去甲肾上腺素) 被膜蛋白主动输送到大致密核囊泡 (LDCVs) 中, 并存储在高浓度 (~ 0.5-1 米)1,2。LDCVs 内神经递质的积累是由儿茶酚胺分子与由 chromogranin 蛋白 (169 毫克/毫升)3,4,5 组成的 intravesicular 致密核心蛋白基质的亲和性完成的. 、6和一个 intravesicular 鸡尾酒解决方案, 其中包含用于儿茶酚胺加载和存储的关键组件, 如 ATP (125-300 mM)7、Ca2 + (解决方案中的50-100 µM 和 ~ 40 毫米绑定到蛋白质矩阵)8, Mg2 + (5 毫米)9, 抗坏血酸 (10-30 毫米)10, pH 值为 ~ 5.511,12。LDCVs 保持一个 iso 渗透条件与细胞细胞质 (310 mOsm/千克)13, 即使理论溶质浓度在囊泡总和高达750毫米。intravesicular 组分的组成不仅对儿茶酚胺的加载和贮存至关重要, 而且对溶质聚集到致密的核心蛋白基质中也是必不可少的。这大大减少了囊泡的渗透, 并可能影响在胞吐作用5, 6 中释放的儿茶酚胺数量.
通过安培记录对细胞外渗透压对胞吐作用过程的影响的研究报告说, 高胞外渗透压抑制胞吐作用活性, 并减少从单一的神经递质分泌的数量囊泡间隔4,14,15,16,17,18,19。对这些观察的解释推测了在细胞胞浆抑制囊泡融合事件中大分子拥挤的可能增强, 以及膜生物物理特性的改变影响了神经递质在胞吐作用期间释放。这些想法假设高胞外渗透应力不影响囊泡量子大小, 这定义了在触发胞吐作用的前一阶段囊泡室中储存的神经递质分子的数量14,15,17,19,20,21. 在单细胞胞吐作用释放量的安培测量中, 碳纤盘微电极与细胞表面紧密接触, 形成模拟突触构型的实验设置, 其中安培电极作为突触后检测器 (图 1)22,23。通过刺激细胞胞吐作用, 可以诱导神经递质囊泡与细胞膜融合, 释放部分或全部囊泡含量进入细胞外空间。在电极表面释放的这些神经递质分子可以电化学检测, 如果神经递质是活性 (例如, 儿茶酚胺) 通过应用氧化还原电位 +700 mV vs 银/AgCl 参考电极.因此, 一系列的电流峰值标志着对个别胞吐作用事件的检测。从安培记录中的电流与时间轨迹, 每一个安培峰值下的区域表示每胞吐作用事件检测到的电荷, 并且可以转换为释放的神经递质的摩尔, 使用法拉第方程。因此, 安培记录提供定量信息的数量的神经递质从单一的胞吐作用事件和报告的频率胞吐作用事件, 但不提供定量信息的分泌性囊泡在囊泡融合和神经递质释放之前的内容已经开始。
因此, 为了更好地理解细胞细胞质分泌囊在细胞被触发接受胞吐作用前对细胞外渗透应力的反应, 其他互补分析方法可以用来丰富这些信息。例如, 研究渗透应力是否改变囊泡体积, 透射电镜 (TEM) 成像分析可用于测定化学固定后细胞的囊泡大小。为探讨渗透胁迫对囊泡量子大小的影响, 一种新近开发的称为胞内电化学细胞术的安培技术, 可用于在分泌性囊泡中定量测定囊泡神经递质含量。在活细胞的细胞质中仍然居住的本机状态26。在细胞内电化学细胞技术中, nanotip 柱状碳纤维电极轻轻地插入活细胞的细胞质中, 并将 +700 mV 电位应用于该电极 (vs a Ag/AgCl 参考电极),在囊泡中儿茶酚胺含量可以通过检测单个囊泡的氧化还原电流峰值来进行量化, 然后在电极表面进行随机破裂, 从而释放出它们的内容。电极表面26。因此, 在电流与时间的跟踪中, 每一个囊泡破裂事件都可能导致电流瞬变, 通过整合每个电流穗的面积, 可以用 Faraday´s 法计算囊泡量子大小。
因此, 通过将囊泡尺寸测量所得的定量信息与囊泡量子大小分析相结合, 经胞内电化学细胞仪记录, 囊泡神经递质浓度也可被确定。这允许囊泡的特征, 当细胞暴露于不同的渗透条件, 并提供了一个更好的看法, 如何水泡可能对细胞外渗透应力反应在胞吐作用之前的阶段。结合这些方法的结果表明, 在胞外高渗透压的存在下, 囊泡收缩和调整其量子大小, 并比较这些测量的相对变化的定量信息表明,收缩时, 囊泡调整其含量和大小以维持恒定的神经递质浓度24。因此, 这种理解对于连接到渗透胁迫下细胞中神经递质释放的观察是有价值的。在这些协议中, 我们描述了使用这三互补方法, 允许描述在他们的家乡环境中分泌的囊泡对细胞外渗透的反应以及这种反应对胞吐作用的影响。过程.除了我们以前关于高渗透压对胞吐作用24 影响的观察外, 我们还提出了进一步的实验, 描述渗透休克后细胞的恢复和多钡刺激在嗜中的作用。细胞.
Protocol
Representative Results
Discussion
我们这里提出了一个协议和三互补分析方法结合分析分泌性囊泡和胞吐作用过程的优点, 以更好地了解渗透压等物理力如何影响分泌性囊泡分泌细胞中的胞吐作用过程。这些方法包括碳纤维微电极探头, 它是一种记录胞吐作用活性的建立方法, 细胞内电化学细胞术, 用于确定量子在其当地环境中的囊泡大小, 并透射电镜图像分析监测分泌囊泡体积。在这项工作中, 通过收集探头记录的定量数据, 在暴?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢瑞典研究理事会 (349-2007-8680) 资助和 Dalsjöfors Kött AB (瑞典 Dalsjöfors) 捐赠牛肾上腺。
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
- Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
- Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
- Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
- Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
- Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
- Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
- Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
- Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
- Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
- Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
- Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
- Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
- Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
- Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
- Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
- Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
- Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
- Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
- Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
- Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
- Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
- Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
- Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
- Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
- Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
- Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
- Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).
