浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視
Summary
浸透圧ストレスは、エキソサイトーシスとこの処理中に解放の神経伝達物質の量に影響します。透過型電子顕微鏡と共に電気化学的方法を組み合わせることを使用エキソサイトーシス活動、小胞素量サイズ、および神経伝達物質解放の量に細胞外の浸透圧の影響を検討することができる方法を紹介します。中に分泌します。
Abstract
分泌細胞は分泌活動と単一の開口放出イベントで小胞から解放の神経伝達物質の量を減らすことによってこの物理的なストレスに応答する高浸透圧刺激を受ける細胞のアンペロメトリー記録。浸透圧ストレス応答の細胞縮小し、仮定した細胞の細胞内分泌小胞を受けません追放の神経伝達物質の減少膜生物物理学的特性の変化のため、それが示唆されています。細胞外浸透圧ストレス。エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録は、瞬間、小胞は細胞膜と融合が、小胞の融合が発生する前に小胞のコンテンツに情報を提供しませんが細胞からリリースが何を監視します。したがって、あるアンペロメトリーを組み合わせることで細胞の開口放出を発生する前に、分泌小胞を特徴付けることができる他の補完的な分析方法と記録、どのように分泌小胞を調べるための広範な概要を提供していますと、高浸透圧刺激による開口放出プロセスを受けます。ここで分泌小胞サイズや神経伝達物質の変化を特徴付けるアンペロメトリーを利用した細胞内電気化学フローサイトメトリーと透過電子顕微鏡 (TEM) イメージング記録を補完するを使用する方法について述べるクロム親和性細胞浸透圧ストレスへの暴露の前後分泌活動に関連して。すべての 3 つの分析方法を用いた実験から得られる定量的な情報をリンクすることによって結論は以前に行われたサイズで縮小する小胞素量サイズを減らすことによって分泌小胞が細胞外浸透圧ストレスに応答します。一定の小胞神経伝達物質濃度を維持します。したがって、これはなぜ小胞、浸透圧ストレス応答削減量神経伝達物質分泌のリリース時に発表に関するいくつかの明確化を提供します。アンペロ メトリック録音をここで示すときに置かれた細胞は、等張性の環境に戻されます、高浸透圧刺激神経伝達物質を充てん後、これは可逆過程とその小胞。
Introduction
副腎髄質の細胞は、神経伝達物質分子を血流に放出神経内分泌のセルです。これはドッキングを含む細胞プロセスとエキソサイトーシスと呼ばれるプロセスの細胞外空間に小胞からコンテンツのリリースで、その結果神経伝達物質で満たされた小胞の融合により発生します。クロム親和性細胞内伝達物質 (アドレナリン、ノルアドレナリン)、積極的に大きい密中心の小胞 (LDCVs) に膜タンパク質によって運ばれ、高濃度 (~0.5-1 M)1,2に格納されます。クロモグラニン蛋白質 (~ 169 mg/mL)3,4,5 から成る小の密度の高い核蛋白質のマトリックスへのカテコールアミン分子の親和性、LDCVs の中の神経伝達物質の蓄積は、します。 ,6、および ATP (125-300 mM)7Ca2 +などの小胞にカテコールアミンの読み込みとストレージの主要なコンポーネントを含む小カクテル ソリューション (ソリューション 〜 40 mM で 50-100 μ M が行き、たんぱく)8、9Mg2 + (5 mM)、アスコルビン酸 (10-30 mM)10、および ~5.511,12の pH。にもかかわらず、ベシクル内理論の溶質濃度を合計 750 mM 以上まで、LDCVs は細胞細胞質 (310 mOsm/kg)13iso 浸透圧条件を維持します。小成分の組成はのみ読み込みと、カテコールアミン、溶質の集計ストレージの密度の高い核蛋白質のマトリックスに必要ではありません。これが激減する小胞の浸透圧が大幅に低下し、エキソサイトーシス5,6時にリリースされる量カテコールアミンに影響を与えることができます。
高細胞外浸透圧分泌活性を阻害してシングルから分泌される神経伝達物質の数が減るに電流記録によるエキソサイトーシス過程に及ぼす細胞外の浸透圧の研究が報告されています。小胞の区画4,14,15,16,17,18,19。これらの観察の説明は、高分子の細胞細胞質阻害小胞融合イベントの数に影響を与える膜生物物理学的特性の変化の可能な強化に推測しています。エキソサイトーシス時解放の神経伝達物質。これらの考えは、高い細胞外浸透圧ストレスがトリガー エキソサイトーシス14,の前段階で小胞のコンパートメントに格納されている神経伝達物質の分子の数を定義する小胞素量サイズを与えないことと見なされます15,17,19,20,21. 単一細胞における分泌リリースのアンペロ メトリック測定、炭素繊維ディスク電極は実験的にシナプス構成を模倣したセットアップを作成する細胞表面と連絡を密に配置されます場所、アンペロ メトリック電極は、シナプス後の検出器 (図 1)22,23として機能します。開口放出する細胞を刺激することによって細胞膜と融合し、細胞外スペースに一部またはにおける小胞の内容を解放する神経伝達物質で満たされた小胞を引き起こすことができる 1 つ。酸化還元電位は 700 mV vs 銀/塩化銀参照電極を適用することによって神経伝達物質 (例えばカテコールアミン) ゲルロボット場合電気化学電極の表面でこれらの神経伝達物質の分子を検出できます。.その結果、電流スパイクのシリーズは、個々 のエキソサイトーシス イベントの検出をマークします。アンペロ メトリックの記録で時間トレース対電流から各単一電流スパイクの下の領域はエキソサイトーシス イベントごとに検出した電荷を表し、リリース、ファラデー方程式を用いた神経伝達物質のモルに変換することができます。したがって、アンペロ メトリック録音単一開口放出イベントから追放された量の神経伝達物質の定量的情報を提供、エキソサイトーシス イベントの頻度に関する報告書が分泌小胞に関する定性的情報はありません。小胞の融合および神経伝達物質のリリース前にコンテンツが開始されました。
したがって、セルにどのように分泌小胞のより良い理解を得るため細胞質に応答細胞外浸透圧ストレス、開口放出を受けるセルを発生する前にこの情報を豊かにする他の補完的な手法を使用できます。例えば、化学固定後細胞の小胞の大きさを測定するため、調べるため浸透圧ストレス小胞のボリュームを変更する場合、透過型電子顕微鏡 (TEM) を画像解析を使用できます。浸透圧ストレス小胞素量サイズに影響を与える場合を調べると、細胞の電気化学的フローサイトメトリーと呼ばれる最近開発されたアンペロ メトリック手法を小胞の分泌小胞神経伝達物質コンテンツの定量化のため適用できるのまだ26生きた細胞の細胞質に存在するときの本来の状態。細胞内電気化学フローサイトメトリー法でナノ針状円筒炭素繊維電極優しく 700 mV の電位をこの電極に適用することによってと生きた細胞の細胞質に挿入されます (対銀/塩化銀参照電極)、衝突、吸着、電極表面で破裂その後確率的とに対してその内容を解放単一の小胞からの酸化還元電流スパイクの検出によって小胞のカテコールアミンの量を定量化することができます、電極表面26。したがって、時間トレース対現在の電流に各単一の小胞の連動イベント過渡電流に可能性があり、各電流スパイクの領域を統合することにより小胞素量サイズは Faraday´s 法を使用して計算することができます。
したがって、細胞の電気化学的フローサイトメトリーで記録された小胞素量サイズ分析と共に電子顕微鏡イメージングを用いた小胞サイズ測定から得られる定量的な情報をリンクすることにより小胞神経伝達物質濃度ことも決定されます。これは細胞がさまざまな浸透圧条件にさらされる小胞のキャラクタリゼーションをことができます、どのように小胞の開口放出する前の段階で細胞外の浸透圧ストレス応答可能性がありますに良いビューを提供します。これらの測定値から相対変化に関する定量的な情報を比較することを示す、細胞外の高浸透圧の存在下での小胞が縮小し、素量サイズ調整からこれらの方法を組み合わせて結果を示しています。縮小中、小胞は、その内容と定数神経伝達物質濃度24を維持するためにサイズを調整します。したがって、このような理解、浸透圧ストレスにさらされた細胞の伝達物質の放出は、観測への接続です。これらのプロトコルで細胞外浸透圧に対応するネイティブ環境でどのように分泌小胞のキャラクタリゼーションと分泌に及ぼすこの応答を許可するこれらの 3 つ補完手法の使用について述べるプロセス。エキソサイトーシス24の高浸透圧の影響について私たちの前の観察、に加えて高浸透圧刺激と髄質で複数のバリウム刺激の効果の後細胞回復を記述する追加の実験を提案します。セルです。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 はここで、プロトコルと分泌小胞や浸透圧などの物理的な力に分泌小胞の影響のより良い理解を得るために開口放出のプロセスを分析する 3 つの補完的な分析手法を組み合わせることの利点を提示します。分泌細胞の開口放出プロセス。これらのメソッドは、エキソサイトーシス活動、彼らのネイティブ環境で小胞の素量サイズを決定するため使用すると、細胞内の電気化学的フローサ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、スウェーデン研究評議会 (349-2007-8680) 資金調達のため、Dalsjöfors コットツーク AB (Dalsjöfors、スウェーデン) ウシ副腎の寄付に感謝したいと思います。
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
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