Surveiller l’effet du Stress osmotique sur les vésicules de sécrétion et exocytose

Summary

Le stress osmotique affecte exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de ce processus. Nous démontrons comment combinant méthodes électrochimiques ainsi que de la microscopie électronique peut être utilisé pour étudier l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur l’activité de l’exocytose, la vésicule quantique taille et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de l’exocytose.

Abstract

Ampérométrie enregistrement des cellules soumises à un choc osmotique Voir la répondant par les cellules sécrétrices à ce stress physique en réduisant l’activité de l’exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré des vésicules dans les événements de l’exocytose unique. Il a été suggéré que la réduction des neurotransmetteurs expulsés est en raison de modifications dans les propriétés biophysiques de la membrane lorsque les cellules se rétrécissement en réponse au stress osmotique et hypothèses que sécrétoires vésicules dans le cytoplasme de la cellule ne sont pas affectés par le stress osmotique extracellulaire. Ampérométrie enregistrement d’exocytose surveille ce qui est libéré des cellules du moment une vésicule fusionne avec la membrane plasmique, mais ne fournit pas d’informations sur le contenu de la vésicule avant la fusion des vésicules est déclenchée. Par conséquent, en combinant ampérométrie enregistrement avec d’autres méthodes analytiques complémentaires qui sont capables de caractériser les vésicules sécrétrices avant l’exocytose à cellules est déclenchée offre un aperçu plus large pour l’examen des vésicules sécrétrices comment et la processus d’exocytose sont affectés par choc osmotique. Nous décrivons ici comment compléter ampérométrie enregistrement intracellulaire cytometry électrochimique et imagerie de microscopie électronique (met) de transmission peut être utilisé pour caractériser les modifications dans le contenu de taille et de neurotransmetteur des vésicules sécrétrices à cellules chromaffines par rapport aux activités de l’exocytose avant et après exposition à un stress osmotique. En liant l’information quantitative tirée des expériences utilisant les trois méthodes d’analyses, conclusions apportées précédemment que les vésicules sécrétrices réagissent au stress osmotique extracellulaire en diminution en taille et en réduisant la taille quantiques de vésicules à maintenir une concentration de neurotransmetteur vésicule constant. Par conséquent, ce qui donne quelques précisions au sujet de pourquoi les vésicules, en réponse au stress osmotique, réduisent les neurotransmetteurs montant libérés au cours de la libération de l’exocytose. Les enregistrements ampérométrique ici indiquent que c’est un processus réversible et que la vésicule après un choc osmotique sont remplis avec les neurotransmetteurs lorsque les cellules placées sont revenues dans un milieu isotonique.

Introduction

Les cellules chromaffines dans les glandes surrénales sont des cellules neuroendocrines qui libèrent des molécules de neurotransmetteur dans la circulation sanguine. Cela se produit à travers un processus cellulaire qui comporte l’arrimage et la fusion de vésicules remplies de neurotransmetteurs, résultant en une libération contenue des vésicules à l’espace extracellulaire dans un processus appelé exocytose. Les neurotransmetteurs (adrénaline et noradrénaline) dans les cellules chromaffines sont activement transportés par les protéines de membrane dans les vésicules de grand noyau dense (LDCVs) et stockés à des concentrations élevées (~0.5-1 M)^1,2. Accumulation de neurotransmetteurs à l’intérieur des LDCVs s’effectue par l’affinité des molécules de catécholamines pour la matrice de protéine de noyau dense intravésiculaire composée de chromogranine protéines (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}et une solution de cocktail intravésiculaire contenant des composants clés pour le chargement de catécholamines et de stockage dans la vésicule tels que l’ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM dans la solution et ~ 40 mM lié à la matrice de protéine)⁸Mg^{2 +} (5 mM)⁹, ascorbate (10-30 mM)¹⁰et un pH de ~5.5^11,12. Les LDCVs maintiennent une condition iso-osmotique avec la cellule cytoplasme (310 mOsm/kg)¹³, même si la concentration en soluté théorique à l’intérieur des vésicules somme jusqu’à plus de 750 mM. La composition des composants intravésiculaire n’est pas seulement essentielle pour le chargement et le stockage des catécholamines, mais aussi pour l’agrégation des solutés à la matrice de protéine de noyau dense. Ceci réduit considérablement l’osmolarité des vésicules est réduit de façon significative et peuvent affecter la catécholamine de quantité qui est libérée au cours de l’exocytose^5,6.

Études sur l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur le processus d’exocytose par ampérométrique enregistrement ont rapporté cette forte pression osmotique extracellulaire inhibe l’activité de l’exocytose et réduit le nombre de neurotransmetteurs sécrétés par simple vésicule compartiments^{4,14,15,16,17,18,19}. Les explications de ces observations ont spéculé sur la possible amélioration d’entassement macromoléculaires dans les événements de fusion cellule cytoplasme inhibant vésicule et une altération des propriétés biophysiques de la membrane affectant le nombre de neurotransmetteurs libérés au cours de l’exocytose. Ces pensées suppose que le stress osmotique extracellulaire élevé n’affecte pas la taille quantiques de vésicules, qui définit le nombre de molécules de neurotransmetteurs stockés dans un compartiment de vésicules au stade préalable d’exocytose déclenchée^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. dans ampérométrique mesures de libération d’exocytose dans des cellules individuelles, une microélectrode de disque Fibre de carbone est placée en contact étroit avec la surface de la cellule, créant ainsi un ensemble expérimental en imitant la configuration de la synapse, où l’ampérométrique électrode sert un détecteur postsynaptique (Figure 1)^22,23. En stimulant une cellule à l’exocytose, on peut induire des vésicules remplies de neurotransmetteurs fusionnent avec la membrane plasmique et de libérer la partie ou le contenu de la vésicule complète dans l’espace extracellulaire. Ces molécules de neurotransmetteur libérés à la surface de l’électrode peuvent être détectées par voie électrochimique si les neurotransmetteurs sont des polymères électroactifs (p. ex., catécholamines) en appliquant un potentiel redox de + 700 mV vs une électrode de référence Ag/AgCl . En conséquence, une série de pointes de courants marquent la détection des événements individuels de l’exocytose. De l’approche actuelle et trace temporelle dans un enregistrement ampérométrique, la zone située sous chaque Picot ampérométrique unique représente la charge détectée par l’événement de l’exocytose et peut être convertie à la taupe des neurotransmetteurs libérés, à l’aide de l’équation de Faraday. Par conséquent, les enregistrements ampérométrique fournissent des informations quantitatives sur les neurotransmetteurs montant expulsés d’événements unique exocytose et rapport sur la fréquence des phénomènes d’exocytose, mais ne présentent pas d’informations quantitatives sur les vésicules de sécrétion contenu avant la fusion des vésicules et la libération des neurotransmetteurs a été lancé.

Par conséquent, pour obtenir une meilleure compréhension de comment sécrétoires vésicules dans la cellule cytoplasme répondre au stress osmotique extracellulaire avant que la cellule est activée pour subir une exocytose, autres méthodes analytiques complémentaires peuvent servir à enrichir ces informations. Par exemple, afin de déterminer si le stress osmotique modifie le volume de la vésicule, microscopie électronique à transmission (TEM) analyse d’imagerie peut servir à mesurer la taille de la vésicule des cellules après fixation chimique. Pour examiner si un stress osmotique affecte la vésicule taille quantique, une technique ampérométrique développée récemment appelée intracellulaire électrochimique cytométrie en flux, peut être appliqué pour la quantification du contenu de neurotransmetteur vésicule en vésicules sécrétrices dans leur état natif alors résident encore dans le cytoplasme des cellules vivantes,²⁶. Dans la technique de cytométrie électrochimique intracellulaire, une électrode cylindrique en fibre de carbone de NANOPOINTES est délicatement insérée dans le cytoplasme de cellules vivantes et, en appliquant un potentiel de mV + 700 à cette électrode (électrode de référence vs un Ag/AgCl), la la teneur en catécholamines dans les vésicules peut être quantifiée par la détection d’un dopage actuel redox des vésicules simples collision, adsorbant et par la suite stochastique une rupture à la surface de l’électrode et libérant ainsi leur contenu contre la électrode de surface²⁶. Ainsi, dans l’ampérométrique actuel contre trace temporelle, chaque événement rompre seule vésicule peut entraîner un courant transitoire et, en intégrant le domaine de chaque épi actuel, la taille quantique de la vésicule peut être calculée à l’aide de Faraday´s Loi.

Par conséquent, en liant l’information quantitative tirée des mesures de taille de vésicule TEM imagerie ainsi qu’analyse de vésicules de taille quantiques, tel qu’enregistré par cytométrie de flux électrochimique intracellulaire, concentration de neurotransmetteur vésicule peut également être déterminée. Cela permet la caractérisation de la vésicule quand les cellules sont exposées à diverses conditions osmotiques et offre une meilleure vue sur comment les vésicules peuvent répondre au stress osmotique extracellulaire au stade avant l’exocytose. Les résultats de la combinaison de ces méthodes ont montré qu’en présence d’une pression osmotique élevée extracellulaire vésicules rétrécissement et ajuster leur taille quantique et en comparant les informations quantitatives sur les variations relatives de ces mesures montre que tout en réduisant, vésicules ajuster leur contenu et les dimensions pour maintenir une concentration de neurotransmetteur constante²⁴. Ainsi, cette compréhension est précieuse en mettant avec les observations faites sur la libération des neurotransmetteurs dans les cellules exposées à un stress osmotique. Dans ces protocoles, nous décrivons l’utilisation de ces trois méthodes complémentaires permettant la caractérisation des vésicules de sécrétion comment dans leur environnement natif de répondre à l’osmolalité extracellulaire et les effets de cette réponse sur l’exocytose processus. En plus de nos observations précédentes concernant l’effet de la pression osmotique élevée sur exocytose²⁴, nous présentons des expériences supplémentaires qui décrivent des cellules après un choc osmotique et l’effet de multiples stimulations de baryum dans chromaffines cellules.

Protocol

1. cellule Culture de cellules chromaffines bovines isolées par Digestion enzymatique des glandes surrénales Pour isoler les cellules chromaffines prélevés dans les glandes surrénales bovines, stériliser les cellules avec la solution d’éthanol à 70 %. Garniture de graisse à l’extérieur et du tissu conjonctif à l’aide d’un scalpel. Pour enlever le sang, rincer les veines surrénaliennes en utilisant une solution de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesul…

Representative Results

Nous décrivons ici le protocole car comment combinant l’imagerie TEM ainsi que deux méthodes électrochimiques, ampérométrie en fibre de carbone et intracellulaire cytometry électrochimique, peut fournir des informations qui acquiert une vision plus large, faisant allusion à l’effet de pression osmotique extracellulaire sur les vésicules de sécrétion et le processus d’exocytose. En comparant les enregistrements ampérométrie représentatif de relâchement de l’exocytose à cellules chromaffines simples …

Discussion

Nous présentons ici un protocole et les avantages de la combinaison de trois méthodes d’analyse complémentaires visant à analyser les vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose à mieux comprendre comment une force physique comme la pression osmotique peut affecter des vésicules sécrétrices et le processus d’exocytose dans les cellules sécrétrices. Ces méthodes incluent la fibre de carbone avec des microélectrodes ampérométrie, qui est une méthode établie pour l’enregistrement de l’acti…

Materials

NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB