Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose
Summary
Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.
Abstract
Strommesstechnik Aufnahme der Zellen ausgesetzt osmotischen Schock zeigen, dass die sekretorische Zellen auf dieser physischen Stress zu reagieren, durch die Reduzierung der Exozytose-Aktivität und die Menge der Neurotransmitter aus Vesikeln im einzigen Exozytose Veranstaltungen veröffentlicht. Es wurde vermutet, dass der Rückgang der Neurotransmitter ausgestoßen aufgrund von Änderungen in Membran Biophysikalische Eigenschaften, ist wenn Zellen als Reaktion auf osmotischen Stress schrumpfen und mit Annahmen, die sekretorischen Vesikel in das Zytoplasma der Zelle sind nicht betroffen durch extrazelluläre osmotischen Stress. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose überwacht, was aus den Zellen im Moment losgelassen wird, den ein Vesikels verschmilzt mit der Plasmamembran, den aber enthält keine Angaben über den Inhalt des Vesikels bevor die Fusion der Vesikel ausgelöst wird. Daher, durch die Kombination strommesstechnik Aufnahme mit anderen ergänzenden analytischen Methoden, die sind in der Lage, die Charakterisierung der sekretorischen Vesikel, bevor Exozytose an Zellen ausgelöst wird bietet einen umfassenderen Überblick für die Prüfung wie sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess werden durch osmotischen Schock betroffen. Wir beschreiben hier, wie ergänzend strommesstechnik Aufnahme mit intrazellulären elektrochemische Zytometrie und Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung kann verwendet werden, um Änderungen im sekretorischen Vesikel Größe und Neurotransmitter an charakterisieren chromaffin Zellen im Zusammenhang mit Exozytose Tätigkeit vor und nach der Exposition auf osmotischen Stress. Durch die Verknüpfung der quantitative Erkenntnisse aus Experimenten mit allen drei analytische Methoden, wurden Schlussfolgerungen zuvor gemacht, dass sekretorischen Vesikel auf extrazelluläre osmotischen Stress reagieren, indem in der Größe schrumpfen und die Vesikel Quanten Größe zu reduzieren behalten Sie eine konstante Vesikel Neurotransmitter Konzentration. Daher gibt das einige Klarstellungen hinsichtlich warum Vesikel, in Reaktion auf osmotischen Stress die Menge Neurotransmitter bei Freigabe Exozytose freigesetzt reduzieren. Die konduktometrische Aufnahmen hier zeigen, dass dies ist ein reversibler Prozess und das telson, nachdem osmotischen Schock mit Neurotransmittern aufgefüllt werden, wenn die gesetzten Zellen in einer isotonischen Umgebung rückgängig gemacht werden.
Introduction
Chromaffin Zellen in Nebennieren sind neuroendokrine Zellen, die Neurotransmitter-Moleküle in die Blutbahn abgeben. Dies geschieht durch ein zellulärer Prozess, bei dem das Andocken, und die Verschmelzung von Neurotransmitter gefüllten Vesikel, was Inhalt Auflösung von Vesikeln in den extrazellulären Raum in einem Prozess namens Exozytose. Die Neurotransmitter (Adrenalin und Noradrenalin) in chromaffin Zellen werden aktiv von Membranproteinen in großen dichten Kern Vesikel (LDCVs) transportiert und bei hohen Konzentrationen (~0.5-1 M)1,2gespeichert. Ansammlung von Neurotransmittern im Inneren der LDCVs geschieht durch die Affinität von Katecholamin-Moleküle zu den intravesicular Rumpfkern Protein-Matrix bestehend aus Chromogranin Proteine (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, und ein intravesicular cocktail Lösung mit Schlüsselkomponenten für Katecholamin-Verladung und Lagerung in die Blase wie ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in der Lösung und ~ 40 mM verpflichtet, die Protein-Matrix)8Mg2 + (5 mM)9, Ascorbat (10-30 mM)10und einem pH-Wert von ~5.511,12. Die LDCVs pflegen einen Iso-osmotischen Zustand der Zelle Zytoplasma (310 mOsm/kg)13, obwohl die theoretische gelöste Konzentration in den Vesikeln Summe bis zu mehr als 750 mM. Die Zusammensetzung der einzelnen intravesicular ist nicht nur wichtig für die Verladung und Lagerung Katecholamine, sondern auch für die Aggregation von gelösten Stoffen, dichten Kern-Protein-Matrix. Dies reduziert die Osmolarität der Vesikel wird deutlich reduziert und beeinflussen die Menge Katecholamin, die während der Exozytose5,6freigegeben wird.
Studien über die Wirkung des extrazellulären osmotischen Drucks auf die Exozytose von amperometrischen Aufnahme haben berichtet, dass hoher extrazellulärer osmotischer Druck hemmt Exozytose Aktivität und reduziert die Anzahl der Neurotransmitter abgesondert von einzelnen Vesikel Fächer4,14,15,16,17,18,19. Die Erklärungen dieser Beobachtungen haben auf die mögliche Verbesserung der makromolekularen Engstand in der Zelle Zytoplasma hemmende Vesikel Fusion Events und eine Veränderung in der Membran Biophysikalische Eigenschaften beeinflussen die Anzahl der spekuliert. Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt. Diese Gedanken angenommen hohen extrazellulären osmotischen Stress beeinflusst nicht die Vesikel Quanten Größe, bestimmt die Anzahl der Neurotransmitter-Moleküle gespeichert in einem Vesikel-Fach in vorherige Phase der getriggerten Exozytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in konduktometrische Messungen der Exozytose Freisetzung in Einzelzellen, eine Kohlefaser-Scheibe Mikroelektrode steht in engem Kontakt mit der Zelloberfläche, erstellen eine experimentelle Einrichtung imitiert die Synapse-Konfiguration, wo der amperometrischen Elektrode dient als ein postsynaptisches Detektor (Abbildung 1)22,23. Durch die Stimulierung einer Zelle, Exozytose, kann ein Neurotransmitter gefüllten Vesikel verschmelzen mit der Plasmamembran der Zelle und lassen teilweise oder volle Blase Inhalt in den extrazellulären Raum auslösen. Diese Neurotransmitter-Moleküle an der Oberfläche der Elektrode veröffentlicht können elektrochemisch erkannt werden, wenn die Neurotransmitter elektroaktive (z.B. Katecholamine) sind durch die Anwendung ein Redoxpotential von 700 mV Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode . Daher eine Reihe von Stromspitzen markieren die Erkennung der einzelnen Exozytose Ereignisse. Vom aktuellen versus Zeit Spur in einer amperometrischen Aufnahme die Anbaufläche jedes einzelnen amperometrischen Spike stellt die Ladung pro Exozytose Ereignis erkannt und der Maulwurf von Neurotransmittern freigegeben, unter Verwendung der Gleichung Faraday konvertiert werden kann. Daher die konduktometrische Aufnahmen liefern quantitative Informationen über die Menge Neurotransmitter aus einzelnen Exozytose Veranstaltungen vertrieben und Berichten über die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse, sondern präsentieren keine quantitative Informationen über die sekretorischen Vesikel Inhalte vor der Fusion der Vesikel und Neurotransmitter-Freisetzung wurde eingeleitet.
Daher, um ein besseres Verständnis der wie sekretorischen Vesikel in der Zelle Zytoplasma reagieren auf extrazelluläre osmotischen Stress bevor die Zelle ausgelöst wird, um zu unterziehen, Exozytose, andere ergänzende analytische Methoden verwendet werden können, um diese Informationen zu bereichern. Zum Beispiel um zu untersuchen, ob osmotischen Stress Vesikel Volumen ändert, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) bildgebende Analyse lässt sich die Vesikelgröße der Zellen nach chemischen Fixierung zu messen. Um zu untersuchen ob osmotischen Stress Quanten Vesikelgröße betrifft, eine neu entwickelte amperometrischen Technik namens intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgebracht werden, für die Quantifizierung der Vesikel Neurotransmitter Inhalt an sekretorischen Vesikel in ihrer nativen Zustand noch im Zytoplasma der lebenden Zellen26wohnhaft. In der intrazellulären elektrochemische Zytometrie-Technik eine Nanotip zylindrischen Kohlefaser-Elektrode sanft das Zytoplasma von lebenden Zellen und durch die Anwendung einer + 700 mV Potenzial an dieser Elektrode eingefügt (Vs Ag/AgCl Referenz Elektrode), die Katecholamin-Inhalte in Vesikeln quantifiziert werden kann, durch den Nachweis einer Redox Stromspitze aus einzelnen Bläschen kollidieren, adsorbierenden, und anschließend stochastisch Brechung an der Elektrodenoberfläche und damit deren Inhalt gegen die Freigabe der Elektrode Oberfläche26. Daher in der amperometrischen aktuelle versus Zeit Spur, jedes einzelne Vesikel zerreißendes Ereignis kann dazu führen, dass eine aktuelle transiente und, durch die Integration von Bereich des jeweils aktuellen Spike, kann Quanten Vesikelgröße mit Faraday´s Gesetz berechnet werden.
Daher kann durch die Verknüpfung der quantitativen Informationen gewonnenen Vesikel Größenmessungen mit TEM Bildgebung Vesikel Quanten Größe und analysiert, wie von intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgezeichnet, Vesikel Neurotransmitter Konzentration auch werden Sie bestimmt. Dies ermöglicht Vesikel Charakterisierung, wenn Zellen unterschiedliche osmotische Bedingungen ausgesetzt sind und bietet eine bessere Sicht wie Bläschen auf extrazelluläre osmotischen Stress in der Phase vor der Exozytose reagieren können. Die Ergebnisse aus der Kombination dieser Methods haben gezeigt, dass im Beisein von extrazellulären hohen osmotischen Druck, Bläschen schrumpfen und passen Sie ihre Quanten Größe und Vergleich der quantitative Informationen über die relativen Veränderungen dieser Messungen, dass zeigt beim schrumpfen anzupassen Vesikel ihre Inhalt und Größe weiterhin eine konstante Neurotransmitter Konzentration24. Somit ist dieses Verständnis wertvolle im Anschluss an die Bemerkungen über Neurotransmitter-Freisetzung in Zellen osmotischen Stress ausgesetzt. In diesen Protokollen beschreiben wir die Verwendung dieser drei komplementäre Methoden, mit denen die Charakterisierung der wie sekretorischen Vesikel in ihrer natürlichen Umgebung reagieren extrazellulären Osmolalität und die Auswirkungen dieser Reaktion auf die Exozytose Prozesses. Zusätzlich zu unseren bisherigen Beobachtungen über die Wirkung der hohen osmotischen Druck auf Exozytose24präsentieren wir weitere Experimente, die Zelle Erholung nach osmotischen Schock und die Wirkung von mehreren Barium Stimulationen in chromaffin beschreiben Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll und die Vorteile der Kombination von drei ergänzende analytische Methoden zur Analyse von sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess besser zu verstehen wie eine physische Kraft wie osmotischen Druck sekretorischen Vesikel auswirken können und der Exozytose Prozess in sekretorischen Zellen. Diese Methoden umfassen die Kohlefaser-Mikroelektrode strommesstechnik, das ist eine etablierte Methode zur Erfassung von Exozytose Aktivität, intrazelluläre elektrochemische Zytometrie, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte der schwedischen Forschungsrat (349-2007-8680) für die Finanzierung und Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Schweden) für die Spende von Rindern Nebennieren zu danken.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
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