Overvågning af effekten af osmotisk Stress på sekretoriske vesikler og exocytose
Summary
Osmotisk stress påvirker exocytose og mængden af neurotransmitteren udgivet under denne proces. Vi demonstrere, hvordan kombinerer elektrokemiske metoder samt transmissions Elektron Mikroskopi kan bruges til at studere effekten af ekstracellulære osmotisk Tryk på exocytose aktivitet, vesikel quantal størrelse og mængden af neurotransmitteren frigivet under exocytose.
Abstract
Amperometry optagelse af celler udsat for osmotisk chok viser, at sekretoriske celler reagerer på denne fysiske stress ved at reducere exocytose aktivitet og mængden af neurotransmitteren frigivet fra vesikler i enkelt exocytose begivenheder. Det er blevet foreslået, at reduktionen af neurotransmittere bortvist er ændringer i membranen biofysiske egenskaber når celler skrumpe i svar til osmotisk stress og med antagelser der sekretoriske vesikler i cellen cytoplasma påvirkes ikke af ekstracellulære osmotisk stress. Amperometry optagelse af exocytose overvåger, hvad er frigivet fra cellerne i øjeblikket en vesikel sikringer med plasma membran, men indeholder ikke oplysninger om vesikel indholdet, før vesikel fusion udløses. Derfor, ved at kombinere amperometry optagelse med andre supplerende analytiske metoder, der er i stand til at karakterisere de sekretoriske vesikler før exocytose på celler udløses tilbyder et bredere overblik for at undersøge hvordan sekretoriske vesikler og den exocytose proces påvirkes af osmotisk chok. Her beskriver vi, hvordan supplerer amperometry optagelse med intracellulære elektrokemiske flowcytometri og transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billedbehandling kan bruges til at karakterisere ændringer i sekretoriske vesikler størrelse og neurotransmitter indhold på chromaffin celler i forbindelse med exocytose aktivitet før og efter udsættelse for osmotisk stress. Ved at sammenkæde de kvantitative oplysninger fra eksperimenter ved hjælp af alle tre analytiske metoder, blev konklusioner tidligere gjort at sekretoriske vesikler reagere ekstracellulære osmotisk stress ved skrumpende størrelse og reducere vesikel quantal størrelse til opretholde en konstant vesikel neurotransmitter koncentration. Derfor, dette giver en afklaring med hensyn til hvorfor blærer, som svar på osmotisk stress, reducere beløbet neurotransmittere frigives under exocytose frigivelse. Amperometric optagelser her angive dette er en reversibel proces og at vesikel efter osmotisk chok er genopfyldes med neurotransmittere, når indsatte celler er vendt i en isotonisk miljø.
Introduction
Chromaffin celler i binyrerne er neuroendokrine celler, der frigiver neurotransmitter molekyler i blodet. Dette sker gennem en cellulær proces, der involverer den docking og fusion af neurotransmitter-fyldt blærer, hvilket resulterer i indhold frigivelse fra vesikler til det ekstracellulære rum i en proces, der kaldes exocytose. Neurotransmittere (adrenalin og noradrenalin) i chromaffin celler er aktivt transporteres af membranproteiner i store tæt kerne vesikler (LDCVs) og opbevares ved høje koncentrationer (~0.5-1 M)1,2. Ophobning af neurotransmittere inde LDCVs opnås ved affinitet af katekolamin molekyler til matrixen intravesicular tæt kerne protein består af chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, og en intravesicular cocktail løsning indeholdende nøglekomponenter for catecholamin lastning og lagring i vesikel som ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM i løsning og ~ 40 mM bundet til den protein matrix)8, Mg2 + (5 mM)9, Ascorbat (10-30 mM)10, og en pH på ~5.511,12. LDCVs opretholde en iso-osmotisk tilstand med cellen cytoplasma (310 mOsm/kg)13, selv om den teoretiske opløste koncentration inde vesikler sum op til mere end 750 mM. Sammensætningen af intravesicular bestanddele er ikke kun vigtig for lastning og lagring af katekolaminer, men også for sammenlægning af opløste stoffer til tæt kerne protein matrix. Dette reducerer vesikler osmolaritet reduceres betydeligt og kan påvirke det beløb katekolamin, der frigives under exocytose5,6.
Undersøgelser på effekten af ekstracellulære osmotisk Tryk på exocytose processen ved amperometric optagelse har rapporteret at høj ekstracellulære osmotisk tryk hæmmer exocytose aktivitet og reducerer antallet af neurotransmittere udskilles fra enkelt vesikel rum4,14,15,16,17,18,19. Forklaringer af disse bemærkninger har spekuleret på, om en eventuel forbedring af makromolekylære fortrængning i cellen cytoplasma hæmmende vesikel fusion begivenheder, og en ændring i membranen biofysiske egenskaber, der påvirker antallet af neurotransmittere frigives under exocytose. Disse tanker antages høj ekstracellulære osmotisk stress ikke påvirker vesikel quantal størrelse, som definerer antallet af neurotransmitter molekyler gemmes i en vesikel rum på forudgående fase udløses exocytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. amperometric målinger af exocytose udgivelse i enkelt celler, en carbon fiber disc mikroelektrode er placeret i tæt kontakt med cellens overflade, at skabe et eksperimenterende sæt op efterligne synapse konfiguration, hvor amperometric elektrode fungerer som en postsynaptiske detektor (figur 1)22,23. Ved at stimulere en celle til exocytose, kan man fremkalde neurotransmitter-fyldt blærer at smelte med plasma cellemembranen og frigive en del eller fuld vesikel indhold i det ekstracellulære rum. Disse neurotransmitter molekyler udgivet på overfladen af elektroden kan påvises elektrokemisk hvis neurotransmitterne er electroactive (fx, katekolaminer) ved at anvende en redox potentiale af +700 mV vs en Ag/AgCl-referenceelektrode . Derfor en række aktuelle pigge mark påvisning af individuelle exocytose begivenheder. Fra nuværende versus tid spor i et amperometric optagelse, området under hver enkelt amperometric spike udgør afgiften opdaget pr. exocytose begivenhed og kan konverteres til muldvarp af neurotransmittere frigivet, ved hjælp af Faraday ligning. Dermed, amperometric optagelser give kvantitative oplysninger om de mængde neurotransmittere bortvist fra enkelt exocytose begivenheder og rapportere om hyppigheden af exocytose begivenheder, men udgør ikke kvantitative oplysninger om de sekretoriske vesikler indhold før vesikel fusion og neurotransmitter frigivelse er blevet indledt.
Derfor, for at få en bedre forståelse af hvordan sekretoriske vesikler i cellen cytoplasma reagere på ekstracellulære osmotisk stress før cellen er udløst for at gennemgå exocytose, andre supplerende analytiske metoder kan bruges til at berige denne information. For eksempel, for at undersøge hvis osmotisk stress ændrer vesikel volumen, kan transmissions elektronmikroskopi (TEM) imaging analyse bruges til at måle vesikel størrelsen af celler efter kemisk fiksering. For at undersøge, om osmotisk stress påvirker vesikel quantal størrelse, en nyligt udviklede amperometric teknik kaldet intracellulære elektrokemiske flowcytometri, kan anvendes til kvantificering af vesikel neurotransmitter indhold på sekretoriske vesikler i deres hjemstat når stadig bor i cytoplasma af levende celler26. I den intracellulære elektrokemiske flowcytometri teknik, et nanotip cylindrisk kulfiber elektrode indsættes forsigtigt i cytoplasma af levende celler, og ved at anvende en +700 mV potentiale til denne elektrode (vs en Ag/AgCl reference elektrode), den katekolamin indhold i blærer kan kvantificeres ved påvisning af en redox nuværende spike fra enkelt vesikler kolliderede, adsorbing, og efterfølgende stochastically brud på elektrode overflade og dermed frigøre deres indholdet mod den elektrode overflade26. Derfor, i amperometric nuværende versus tid spor hver enkelt vesikel brud begivenhed kan resultere i en nuværende forbigående og, ved at integrere området i hvert nuværende spike, vesikel quantal størrelse kan beregnes ved hjælp af Faraday´s lov.
Derfor, ved at sammenkæde de kvantitative oplysninger fra vesikel størrelse målinger ved hjælp af TEM billedbehandling samt vesikel quantal størrelse analyse, som er registreret af intracellulære elektrokemiske flowcytometri, vesikel neurotransmitter koncentration kan også bestemmes. Dette tillader vesikel karakterisering, når cellerne er udsat for forskellige osmotisk betingelser og giver et bedre syn på hvordan blærer kan reagere på ekstracellulære osmotisk stress på stadiet før exocytose. Resultater fra kombinerer disse metoder har vist at i nærværelse af ekstracellulære højt osmotisk tryk, vesikler skrumpe og justere deres quantal størrelse og sammenligne de kvantitative oplysninger om de relative ændringer fra disse målinger viser, at mens krympning justere vesikler deres indhold og størrelse til at opretholde en konstant neurotransmitter koncentration24. Således, denne forståelse er værdifulde i tilslutning til bemærkninger på neurotransmitter frigivelse i celler udsat for osmotisk stress. I disse protokoller beskriver vi brugen af disse tre komplementære metoder, der giver mulighed for karakterisering af hvordan sekretoriske vesikler i deres oprindelige miljø reagere på ekstracellulære osmolalitet og virkningerne af dette svar på exocytose proces. Ud over vores tidligere bemærkninger vedrørende effekten af høje osmotisk Tryk på exocytose24præsenterer vi yderligere eksperimenter, der beskriver celle opsving efter osmotisk chok og effekten af flere barium stimulering i chromaffin celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her en protokol og fordelene ved at kombinere tre supplerende analytiske metoder til at analysere sekretoriske vesikler og exocytose processen med at få en bedre forståelse af, hvordan en fysisk magt som osmotiske tryk kan påvirke sekretoriske vesikler og exocytose proces i sekretoriske celler. Disse metoder omfatter kulfiber mikroelektrode amperometry, som er en etableret metode til registrering af exocytose aktivitet, intracellulære elektrokemiske flowcytometri, der bruges til at bestemme quantal st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke det svenske Forskningsråd (349-2007-8680) for finansiering og Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Sverige) for donation af kvæg binyrerne.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
- Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
- Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
- Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
- Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
- Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
- Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
- Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
- Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
- Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
- Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
- Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
- Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
- Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
- Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
- Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
- Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
- Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
- Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
- Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
- Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
- Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
- Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
- Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
- Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
- Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
- Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
- Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).
