स्रावी बुलबुले और Exocytosis पर आसमाटिक तनाव के प्रभाव की निगरानी
Summary
आसमाटिक तनाव exocytosis और न्यूरोट्रांसमीटर इस प्रक्रिया के दौरान जारी की मात्रा को प्रभावित करता है. हम प्रदर्शन कैसे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ विद्युत तरीकों के संयोजन के लिए exocytosis गतिविधि पर extracellular आसमाटिक दबाव के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है, पुटिका quantal आकार, और न्यूरोट्रांसमीटर की राशि जारी दौरान exocytosis.
Abstract
आसमाटिक शॉक के अधीन कोशिकाओं की Amperometry रिकॉर्डिंग स्रावी कोशिकाओं exocytosis गतिविधि और न्यूरोट्रांसमीटर एकल exocytosis घटनाओं में बुलबुले से जारी की मात्रा को कम करने के द्वारा इस शारीरिक तनाव का जवाब है कि दिखा. यह सुझाव दिया गया है कि न्यूरोट्रांसमीटर निष्कासित में कमी झिल्ली में परिवर्तन के कारण है भौतिक गुण जब कोशिकाओं आसमाटिक तनाव के जवाब में हटना और मांयताओं के साथ बनाया है कि सेल कोशिका द्रव्य में स्रावी बुलबुले प्रभावित नहीं कर रहे हैं तक extracellular आसमाटिक तनाव । exocytosis पर नज़र रखता है की Amperometry रिकॉर्डिंग क्या कोशिकाओं से जारी है पल एक पुटिका प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, लेकिन पुटिका सामग्री पर जानकारी प्रदान नहीं करता है इससे पहले कि पुटिका फ्यूजन ट्रिगर है । इसलिए, अंय पूरक विश्लेषणात्मक तरीके है कि कोशिकाओं पर exocytosis से पहले स्रावी बुलबुले निस्र्पक में सक्षम है के साथ amperometry रिकॉर्डिंग के संयोजन से ट्रिगर है कैसे स्रावी बुलबुले की जांच के लिए एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है और exocytosis प्रक्रिया आसमाटिक सदमे से प्रभावित हैं । हम यहाँ intracellular विद्युत cytometry और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग के साथ amperometry रिकॉर्डिंग पूरक का वर्णन कैसे स्रावी बुलबुले आकार और न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री में परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आसमाटिक तनाव से पहले और बाद में जोखिम exocytosis गतिविधि के संबंध में chromaffin कोशिकाओं । मात्रात्मक जानकारी सभी तीन विश्लेषणात्मक तरीकों का उपयोग कर प्रयोगों से प्राप्त जोड़ने के द्वारा, निष्कर्ष पहले किया गया है कि स्रावी बुलबुले के आकार में सिकुड़ते और पुटिका quantal आकार को कम करने से आसमाटिक तनाव extracellular का जवाब एक निरंतर पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता बनाए रखें. इसलिए, इस के बारे में कुछ स्पष्टीकरण देता है क्यों बुलबुले, आसमाटिक तनाव के जवाब में, मात्रा exocytosis रिहाई के दौरान जारी न्यूरोट्रांसमीटर कम । amperometric रिकॉर्डिंग यहां संकेत यह एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है और कि पुटिका के बाद आसमाटिक सदमे न्यूरोट्रांसमीटर के साथ फिर से भर रहे हैं जब रखा कोशिकाओं को एक isotonic वातावरण में वापस आ रहे हैं.
Introduction
अधिवृक्क ग्रंथि में Chromaffin कोशिकाओं neuroendocrine कोशिकाओं है कि रक्त प्रवाह में न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं जारी कर रहे हैं. यह एक सेलुलर प्रक्रिया है कि डॉकिंग और न्यूरोट्रांसमीटर भरा बुलबुले के फ्यूजन शामिल है के माध्यम से होता है, exocytosis नामक एक प्रक्रिया में extracellular अंतरिक्ष के लिए बुलबुले से सामग्री रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप. chromaffin कोशिकाओं में न्यूरोट्रांसमीटर (एड्रेनालाईन और noradrenaline) सक्रिय रूप से बड़े घने कोर बुलबुले (LDCVs) में झिल्ली प्रोटीन द्वारा ले जाया जाता है और उच्च सांद्रता (~ 0.5-1 मीटर)1,2पर संग्रहीत । LDCVs अंदर न्यूरोट्रांसमीटर के संचय intravesicular घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स chromogranin प्रोटीन के शामिल करने के लिए catecholamine अणुओं के संबध द्वारा पूरा किया जाता है (~ १६९ मिलीग्राम/एमएल)3,4,5 ,6, और catecholamine लोड हो रहा है और इस तरह के एटीपी के रूप में पुटिका में भंडारण के लिए प्रमुख घटकों से युक्त एक intravesicular कॉकटेल समाधान (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 समाधान में µ मीटर और ~ ४० mm करने के लिए बाध्य प्रोटीन मैट्रिक्स)8, मिलीग्राम2 + (5 मिमी)9, ascorbate (10-30 मिमी)10, और एक पीएच के ~ ५.५11,12. LDCVs कक्ष कोशिका द्रव्य (३१० mOsm/kg) 13 के साथ एक iso-आसमाटिक शर्त बनाए रखता है, भले ही बुलबुले के अंदर सैद्धांतिक घुला हुआ एकाग्रता ७५० mM से अधिक तक योग करता है । intravesicular घटकों की संरचना न केवल catecholamines के लदान और भंडारण के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी solutes के एकत्रीकरण के लिए घने कोर प्रोटीन मैट्रिक्स के लिए । यह काफी कम हो जाती है बुलबुले के osmolarity काफी कम हो जाता है और exocytosis के दौरान जारी किया गया है कि राशि catecholamine को प्रभावित कर सकते हैं,6.
amperometric रिकॉर्डिंग द्वारा exocytosis प्रक्रिया पर extracellular आसमाटिक दबाव के प्रभाव पर अध्ययन ने बताया है कि उच्च extracellular आसमाटिक दबाव exocytosis गतिविधि को रोकता है और न्यूरोट्रांसमीटर एकल से स्रावित की संख्या कम कर देता है पुटिका कंपार्टमेंट4,14,15,16,17,18,19। इन टिप्पणियों के स्पष्टीकरण सेल में भीड़ macromolecular की संभव वृद्धि पर अटकलें लगाई है कोशिका द्रव्य बाधा पुटिका फ्यूजन की घटनाओं, और झिल्ली में परिवर्तन एक भौतिक की संख्या को प्रभावित संपत्तियों न्यूरोट्रांसमीटर exocytosis के दौरान जारी किया. इन विचारों का मानना है कि उच्च extracellular आसमाटिक तनाव पुटिका quantal आकार, जो न्यूरोट्रांसमीटर पुटिका के पूर्व चरण में एक exocytosis डिब्बे में संग्रहीत अणुओं की संख्या को परिभाषित करता है प्रभावित नहीं होता है14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. एकल कोशिकाओं में exocytosis रिहाई के amperometric माप में, एक कार्बन फाइबर डिस्क microelectrode सेल सतह के साथ निकट संपर्क में रखा गया है, एक प्रयोगात्मक सेट अप synapse विंयास, नकल उतारना बनाने जहां amperometric इलेक्ट्रोड एक postsynaptic डिटेक्टर के रूप में कार्य करता है (चित्रा 1)22,23. exocytosis के लिए एक सेल उत्तेजक द्वारा, एक न्यूरोट्रांसमीटर भरा बुलबुले के लिए सेल प्लाज्मा झिल्ली और रिहाई भाग या extracellular अंतरिक्ष में पूर्ण पुटिका सामग्री के साथ फ्यूज करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं. इन न्यूरोट्रांसमीटर इलेक्ट्रोड की सतह पर जारी अणुओं electrochemically का पता लगाया जा सकता है अगर न्यूरोट्रांसमीटर electroactive हैं (उदा, catecholamines) के एक redox क्षमता लागू करने से + ७०० एमवी बनाम एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड . नतीजतन, वर्तमान spikes की एक श्रृंखला अलग exocytosis घटनाओं का पता लगाने के निशान । एक amperometric रिकॉर्डिंग में वर्तमान बनाम समय का पता लगाने से, प्रत्येक एकल amperometric स्पाइक के तहत क्षेत्र exocytosis घटना के प्रति पाया आरोप का प्रतिनिधित्व करता है और फैराडे समीकरण का उपयोग कर, जारी न्यूरोट्रांसमीटर के तिल में परिवर्तित किया जा सकता है. इसलिए, amperometric रिकॉर्डिंग मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर एकल exocytosis घटनाओं से निष्कासित कर दिया और exocytosis घटनाओं की आवृत्ति पर रिपोर्ट पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन स्रावी बुलबुले पर मात्रात्मक जानकारी मौजूद नहीं है पुटिका फ्यूजन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज से पहले सामग्री शुरू की गई है ।
इसलिए, कैसे सेल कोशिका द्रव्य में स्रावी बुलबुले के लिए एक बेहतर समझ पाने के लिए extracellular आसमाटिक तनाव का जवाब सेल से पहले exocytosis से गुजरना शुरू हो रहा है, अंय पूरक विश्लेषणात्मक तरीके इस जानकारी को समृद्ध किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि आसमाटिक तनाव पुटिका मात्रा में परिवर्तन की जांच करने के लिए, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) इमेजिंग विश्लेषण रासायनिक निर्धारण के बाद कोशिकाओं के पुटिका आकार को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जांच करने के लिए अगर आसमाटिक तनाव पुटिका quantal आकार, हाल ही में विकसित amperometric intracellular विद्युत cytometry नामक तकनीक को प्रभावित करता है, ठहराव में पुटिका में न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री के स्रावी के लिए लागू किया जा सकता है में बुलबुले उनके देशी राज्य जब अभी भी जीवित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में 26 रहते हैं । intracellular विद्युत cytometry तकनीक में, एक nanotip बेलनाकार कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड धीरे रहते कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में डाला जाता है और, इस इलेक्ट्रोड के लिए एक + ७०० एमवी क्षमता लागू करने के द्वारा (बनाम एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड), बुलबुले में catecholamine सामग्री एकल बुलबुले टकराने से एक redox वर्तमान स्पाइक का पता लगाने के द्वारा quantified जा सकता है, adsorbing, और बाद में इलेक्ट्रोड सतह पर stochastically rupturing और इस तरह के खिलाफ अपनी सामग्री को रिहा इलेक्ट्रोड26सतह । इसलिए, amperometric वर्तमान बनाम समय ट्रेस में, प्रत्येक एकल पुटिका rupturing घटना एक वर्तमान क्षणिक में परिणाम कर सकते हैं और, प्रत्येक वर्तमान स्पाइक के क्षेत्र को एकीकृत करके, पुटिका quantal आकार फैराडे ´ एस कानून का उपयोग कर गणना की जा सकती है.
इसलिए, मात्रात्मक जानकारी से प्राप्त पुटिका आकार मापन पुटिका quantal आकार विश्लेषण के साथ एक साथ उनि इमेजिंग का उपयोग करके, के रूप में intracellular विद्युत cytometry द्वारा दर्ज की गई, पुटिका न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता भी कर सकते हैं निर्धारित किया जाए । यह पुटिका लक्षण वर्णन की अनुमति देता है जब कोशिकाओं को विभिंन आसमाटिक शर्तों को उजागर कर रहे है और कैसे बुलबुले के मंच पर extracellular आसमाटिक तनाव का जवाब हो सकता है पहले exocytosis पर एक बेहतर विचार प्रदान करता है । इन तरीकों के संयोजन से परिणाम से पता चला है कि extracellular उच्च आसमाटिक दबाव की उपस्थिति में, बुलबुले हटना और उनके quantal आकार को समायोजित करने और इन माप से संबंधित परिवर्तन पर मात्रात्मक जानकारी की तुलना से पता चलता है कि सिकुड़ते हुए, बुलबुले उनकी सामग्री और आकार को समायोजित करने के लिए एक निरंतर न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता बनाए रखने के लिए24. इस प्रकार, यह समझ आसमाटिक तनाव को उजागर कोशिकाओं में न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई पर किए गए टिप्पणियों से जोड़ने में मूल्यवान है. इन प्रोटोकॉल में, हम इन तीन पूरक तरीके के उपयोग का वर्णन है कि कैसे अपने पैतृक वातावरण में स्रावी बुलबुले के लक्षण वर्णन की अनुमति extracellular परासरणीयता और exocytosis पर इस प्रतिक्रिया के प्रभाव का जवाब प्रक्रिया. हमारे पिछले exocytosis पर उच्च आसमाटिक दबाव के प्रभाव के बारे में टिप्पणियों के अलावा24, हम आसमाटिक सदमे और chromaffin में कई बेरियम उत्तेजना के प्रभाव के बाद सेल वसूली का वर्णन है कि अतिरिक्त प्रयोग वर्तमान कोशिकाओं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां एक प्रोटोकॉल और तीन पूरक विश्लेषणात्मक तरीकों के संयोजन के लाभ स्रावी बुलबुले और exocytosis प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए कैसे एक शारीरिक बल जैसे आसमाटिक दबाव स्रावी बुलबुले को प्रभावित कर सकते …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए धन और Dalsjöfors Kött अटल बिहारी (Dalsjöfors, स्वीडन) गोजातीय अधिवृक्क ग्रंथियों के दान के लिए स्वीडिश अनुसंधान परिषद (349-2007-8680) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
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