Overvåke effekten av osmotisk Stress på sekretoriske blemmer og Exocytosis
Summary
Osmotisk stress påvirker exocytosis og mengden av nevrotransmitter utgitt under denne prosessen. Vi viser hvordan kombinere elektrokjemiske metoder med overføring elektronmikroskop kan brukes å studere effekten av ekstracellulære osmotisk Trykk på exocytosis aktivitet, vesicle quantal størrelse og mengden av nevrotransmitter utgitt i løpet av exocytosis.
Abstract
Amperometry opptak av celler underlegges osmotisk sjokk viser at sekretoriske cellene reagerer denne fysisk stress ved å redusere exocytosis aktiviteten og mengden av nevrotransmitter løslatt fra blemmer i enkelt exocytosis hendelser. Det har blitt foreslått at reduksjonen i nevrotransmittere utvist skyldes endringer i membranen Biofysiske egenskaper når celler krympe svar osmotisk stress og med forutsetningene som påvirkes ikke sekretoriske blemmer i cellen cytoplasma av ekstracellulære osmotisk stress. Amperometry opptak av exocytosis overvåker hva slippes fra celler øyeblikket en vesicle sikringer med plasma membranen, men ikke gir informasjon på vesicle innholdet før vesicle fusion utløses. Derfor ved å kombinere amperometry opptak med andre komplementære analytiske metoder som kan karakteriserer sekretoriske blemmer før exocytosis på celler utløses gir en bredere oversikt for å undersøke hvordan sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen påvirkes av osmotisk sjokk. Her beskriver vi hvordan utfyller amperometry med intracellulære elektrokjemisk cytometri og overføring elektronmikroskop (TEM) bildebehandling kan brukes til å simulere endringer i sekretoriske blemmer størrelse og nevrotransmitter innhold på chromaffin celler i forhold til exocytosis aktivitet før og etter eksponering for osmotisk stress. Ved å koble kvantitativ informasjon fra eksperimenter ved hjelp av alle tre analytiske metoder, var konklusjoner tidligere gjort at sekretoriske blemmer svare på ekstracellulære osmotisk stress av krymper i størrelse og redusere vesicle quantal størrelsen til opprettholde en konstant vesicle nevrotransmitter konsentrasjon. Derfor gir noen avklaring vedrørende hvorfor blemmer, svar på osmotisk stress, redusere mengden nevrotransmittere utgitt under exocytosis utgivelsen. Amperometric opptak her angi er en reversibel prosess og at vesicle etter osmotisk sjokk er fylles opp med nevrotransmittere når plassert celler er tilbakestilt i et isotonisk miljø.
Introduction
Chromaffin celler i binyrene er neuroendocrine celler som slipper nevrotransmitter molekyler i blodet. Dette skjer gjennom en mobilnettet prosess som involverer dokkingstasjon og blanding av nevrotransmitter-fylte blemmer, noe som resulterer i innhold release fra blemmer til den ekstracellulære plassen i en prosess som kalles exocytosis. Nevrotransmittere (adrenalin og noradrenalin) i chromaffin celler er aktivt fraktet med membran proteiner i store tett kjernen blemmer (LDCVs) og lagret på høye konsentrasjoner (~0.5-1 M)1,2. Akkumulering av nevrotransmittere inne LDCVs oppnås ved affinitet katekolaminer molekyler til intravesicular tett kjernen protein matrix består av chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, og en intravesicular cocktail løsning som inneholder viktige komponenter for katekolaminer lasting og lagring i vesicle som ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM i løsningen og ~ 40 mM bundet til den protein matrix)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbate (10-30 mM)10og en pH på ~5.511,12. LDCVs opprettholde en iso-osmotisk tilstand med cellen cytoplasma (310 mOsm/kg)13, selv om den teoretiske stoff konsentrasjonen i blemmer summere opp mer enn 750 mM. Sammensetningen av intravesicular komponentene er ikke bare viktig for lasting og lagring av katekolaminer, men også for samling av solutes til tett kjernen protein matrix. Dette reduserer osmolaritet av blemmer reduseres betydelig og kan påvirke mengden katekolaminer som slippes i løpet av exocytosis5,6.
Studier av effekten av ekstracellulære osmotisk Trykk på exocytosis prosessen av amperometric innspillingen har rapportert at høy ekstracellulære osmotisk trykk hemmer exocytosis aktivitet og reduserer antall nevrotransmittere skilles ut fra én vesicle rom4,14,15,16,17,18,19. Forklaringene av disse observasjonene har spekulert på mulig styrking av macromolecular trengsel i cellen cytoplasma hemme vesicle fusion hendelsene, og en endring i membranen Biofysiske egenskaper påvirker antall nevrotransmittere utgitt under exocytosis. Disse tankene antatt at høy ekstracellulære osmotisk stress ikke påvirker vesicle quantal størrelsen, som definerer antallet nevrotransmitter molekyler lagret i en vesicle kupé på tidligere stadium av utløste exocytosis14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. amperometric målinger av exocytosis utgivelse i enkeltceller, en karbonfiber platen microelectrode er plassert i nær kontakt med celleoverflaten, lage en eksperimentell sett opp mimicking synapse konfigurasjonen, hvor amperometric elektroden fungerer som en postsynaptic detektor (figur 1)22,23. Ved å stimulere en celle til exocytosis, kan en indusere nevrotransmitter-fylte blemmer å fusjonere med plasma cellemembranen og slipp del eller hele vesicle innholdet i den ekstracellulære plassen. Disse nevrotransmitter molekylene utgitt på overflaten av elektroden kan oppdages electrochemically hvis signalstoffer electroactive (f.eks, katekolaminer) ved å bruke et redoks potensial på 700 mV vs en Ag/AgCl referanse elektrode . Derfor en rekke gjeldende toppene merke påvisning av personlige exocytosis hendelser. Fra gjeldende versus tid spor i en amperometric innspillingen, området under hver enkelt amperometric spiss representerer tillegget oppdaget per exocytosis hendelse og kan konverteres til Molo av nevrotransmittere slippes ved å bruke Faraday ligningen. Derfor amperometric opptakene gir kvantitativ informasjon om beløpet nevrotransmittere utvist fra enkelt exocytosis hendelser og rapportere om frekvensen av exocytosis hendelser, men presentere ikke kvantitativ informasjon om sekretoriske blemmer innholdet før vesicle fusion og nevrotransmitter-løslate er startet.
Derfor, for å få en bedre forståelse av hvordan sekretoriske blemmer i cellen cytoplasma svare ekstracellulære osmotisk stress før cellen utløses for å gjennomgå exocytosis, andre komplementære analytiske metoder kan brukes til å berike denne informasjonen. For eksempel, for å undersøke om osmotisk stress endrer vesicle volum, kan overføring elektronmikroskop (TEM) imaging analyse brukes til å måle vesicle størrelsen på cellene etter kjemiske fiksering. For å undersøke om osmotisk stress påvirker vesicle quantal størrelse, en nylig utviklet amperometric teknikk som kalles intracellulær elektrokjemisk cytometri, kan brukes for kvantifisering av vesicle nevrotransmitter innhold på sekretoriske blemmer i deres opprinnelig tilstand når fremdeles bosatt i cytoplasma lever celler26. I intracellulær elektrokjemisk cytometri teknikken, en nanotip sylindriske karbonfiber elektrode forsiktig inn i cytoplasma av levende celler og, ved å bruke en 700 mV potensialet denne elektrode (vs en Ag/AgCl referanse elektrode), den katekolaminer innhold i blemmer kan kvantifiseres ved påvisning av en redoks gjeldende spike fra enkelt blemmer kolliderer, adsorbing, og senere stochastically rupturing på elektroden overflaten, og dermed slippe innholdet mot den elektroden overflaten26. Derfor, i amperometric gjeldende versus tid sporing, hver enkelt vesicle rupturing hendelse kan resultere i en gjeldende forbigående og ved å integrere området av hver gjeldende spiker, vesicle quantal størrelsen kan beregnes Faraday´s lov.
Derfor ved å koble kvantitative opplysningene du får vesicle størrelse mål med TEM bildebehandling med vesicle quantal størrelse analyse, som er registrert av intracellulær elektrokjemisk cytometri, kan vesicle nevrotransmitter konsentrasjon også være bestemt. Dette gjør vesicle karakterisering når celler er utsatt for ulike osmotisk forhold og gir en bedre visning på hvordan blemmer kan svare på ekstracellulære osmotisk stress på scenen før exocytosis. Resultatene fra kombinere disse metodene har vist at i nærvær av ekstracellulære høy osmotisk trykk, blemmer krympe og justere quantal størrelse og sammenligne kvantitativ informasjon om de relative endringene fra disse målingene viser at mens krymper justere blemmer innholdet og størrelse å opprettholde en konstant nevrotransmitter konsentrasjon24. Derfor er denne forståelsen verdifullt i koble til observasjoner på nevrotransmitter utgivelse i celler utsatt for osmotisk stress. I disse protokollene beskrive vi bruken av disse tre komplementære metoder som tillate karakterisering av hvordan sekretoriske blemmer i sine opprinnelige omgivelser svare på ekstracellulære osmolality og effekten av dette svaret på exocytosis prosessen. I tillegg til våre tidligere observasjoner om effekten av høy osmotisk Trykk på exocytosis24presenterer vi flere eksperimenter som beskriver celle utvinning etter osmotisk sjokk og effekten av flere barium stimulations i chromaffin celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer her en protokoll og fordelene ved å kombinere tre komplementære analytiske metoder for å analysere sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen for å få en bedre forståelse av hvordan en fysisk makt som osmotiske trykket kan påvirke sekretoriske blemmer og exocytosis prosessen i sekretoriske celler. Disse metodene omfatter karbonfiber microelectrode amperometry, som er en etablert metode for registrering av exocytosis aktivitet, intracellulær elektrokjemisk cytometri, som brukes til å fastsette qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke den svenske Research Council (349-2007-8680) for finansiering og Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Sverige) for donasjon av bovin binyrene.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
- Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
- Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
- Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
- Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
- Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
- Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
- Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
- Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
- Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
- Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
- Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
- Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
- Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
- Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
- Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
- Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
- Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
- Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
- Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
- Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
- Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
- Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
- Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
- Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
- Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
- Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
- Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).
