Övervaka effekten av osmotisk Stress på sekretoriska vesikler och exocytos

Summary

Osmotisk stress påverkar exocytos och mängden signalsubstans släppt under denna process. Vi visar hur kombinera elektrokemiska metoder tillsammans med transmissionselektronmikroskopi kan användas för att studera effekten av extracellulära osmotiska trycket på exocytos aktivitet, vesikler kvantfysikaliska storlek och mängden signalsubstans släppt under exocytos.

Abstract

Amperometry inspelning av celler utsätts för osmotiska chock visar att sekretoriska celler svarar på denna fysiska stress genom att minska aktiviteten exocytos och mängden signalsubstans som släppt från blåsor i enda exocytos händelser. Det har föreslagits att minskningen av signalsubstanser utvisas beror på förändringar i membran biofysiska egenskaper när celler krympa svar på osmotisk stress och med antaganden som sekretoriska vesikler i cellens cytoplasma påverkas inte av extracellulära osmotisk stress. Amperometry inspelning av exocytos övervakar vad frisätts från cellerna nu en vesikel säkringar med plasmamembranet, men ger inte information om vesikler innehållet innan vesikler fusion utlöses. Därför, genom att kombinera amperometry inspelning med andra kompletterande analytiska metoder som kan karaktärisera de sekretoriska vesikler innan exocytos vid celler utlöses erbjuder en bredare överblick för att pröva hur sekretoriska vesikler och exocytos processen påverkas av osmotiska chock. Här beskriver vi hur kompletterar amperometry inspelning med intracellulära elektrokemiska flödescytometri och överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging kan användas för att karaktärisera förändringar i sekretoriska vesikler storlek och signalsubstansen innehåll på chromaffin celler i förhållande till exocytos verksamhet före och efter exponering för osmotisk stress. Genom att länka den kvantitativa informationen från experiment med alla tre analytiska metoder, gjorts slutsatser tidigare att sekretoriska vesikler svarar på extracellulära osmotisk stress genom minskat i storlek och minska vesikler kvantfysikaliska storlek till upprätthålla en konstant vesikler neurotransmittorn koncentration. Detta ger därför ett förtydligande angående varför blåsor, som svar på osmotisk stress, minska mängden neurotransmittorer frigörs vid exocytos release. Amperometrisk inspelningarna här tyder detta en reversibel process och att vesikler efter osmotiska chock är återfyllas med signalsubstanser när placerade celler återställs till en isoton miljö.

Introduction

Chromaffin celler i binjurarna är neuroendokrina celler som frigör signalsubstansen molekyler i blodet. Detta sker genom en cellulär process som involverar dockning och fusion av signalsubstansen-fyllda blåsor, vilket resulterar i innehåll frigörare från blåsor till det extracellulära utrymmet i en process som kallas exocytos. Signalsubstanserna (adrenalin och noradrenalin) i chromaffin celler är aktivt transporteras av membranproteiner in stora tät kärna blåsor (LDCVs) och lagras vid höga koncentrationer (~0.5-1 M)^1,2. Ackumulering av neurotransmittorer inuti LDCVs åstadkoms av katekolamin molekyler affinitet till intravesicular tät kärna protein matrix består av chromogranin proteiner (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}, och en intravesicular cocktail lösning som innehåller viktiga komponenter för katekolamin lastning och lagring i vesikler som ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM i lösning och ~ 40 mM bunden till den protein matrix)⁸Mg^{2 +} (5 mM)⁹, askorbat (10-30 mM)¹⁰och ett pH på ~5.5^11,12. LDCVs bibehålla en isoosmotisk tillstånd med cell cytoplasman (310 mOsm/kg)¹³, även om den teoretiska lösningens koncentrationen inuti blåsor summera upp till mer än 750 mM. Sammansättningen av intravesicular komponenter är inte bara viktigt för lastning och lagring av katekolaminer, men också för aggregering av koncentrationsfördelningen till tät kärna protein matrix. Vilket avsevärt minskar blåsor osmolaritet minskas avsevärt och kan påverka de belopp katekolamin som frigörs under exocytos^5,6.

Studier på effekten av extracellulära osmotiska trycket på processen exocytos av amperometrisk inspelning har rapporterat att höga extracellulära osmotiska trycket hämmar exocytos aktivitet och minskar antalet neurotransmittorer som utsöndras från singel vesikler fack^{4,14,15,16,17,18,19}. Förklaringar av dessa observationer har spekulerat om möjligt förbättrande av makromolekylära trängs i cell cytoplasman hämmande vesikler fusion händelserna, och en förändring i membran biofysiska egenskaper som påverkar antalet neurotransmittorer frigörs vid exocytos. Dessa tankar antas att höga extracellulära osmotisk stress inte påverkar vesikler kvantfysikaliska storlek, som definierar antalet signalsubstansen molekyler lagras i vesikler kupé i tidigare skede av utlösta exocytos^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. i amperometrisk mätningar av exocytos release i enstaka celler, en kolfiber skiva mikroelektrod placeras i nära kontakt med cellytan, skapa en experimentell uppsättning upp härma synaps konfiguration, där amperometrisk elektroden fungerar som en postsynaptiska detektor (figur 1)^22,23. Genom att stimulera en cell till exocytos, förmå en neurotransmittor-fyllda blåsor till säkring med plasma cellmembranet och släppa en del eller hela vesikler innehållet i det extracellulära utrymmet. Dessa signalsubstansen molekyler släppt på ytan av elektroden kan upptäckas elektrokemiskt om signalsubstanser är elektroaktiva (t.ex., katekolaminer) genom att tillämpa en redoxpotential av +700 mV vs en referenselektrod av Ag/Granulatfyllda . Följaktligen, markera en rad aktuella spikar detektion av enskilda exocytos händelser. Från nuvarande kontra tid spår i en amperometrisk inspelning, området under varje enskild amperometrisk spike representerar den avgift som upptäckts per exocytos händelse och kan omvandlas till Mullvaden av signalsubstanser som släppt, med hjälp av Faraday ekvation. Därför amperometrisk inspelningarna ger kvantitativ information om mängden signalsubstanser utvisas från enda exocytos händelser och rapportera om frekvensen av exocytos händelser, men innebär inte kvantitativa uppgifter om de sekretoriska vesikler innehåll tidigare vesikler fusion och neurotransmitterfrigöraren har inletts.

Därför, för att få en bättre förståelse för hur sekretoriska vesikler i cellen cytoplasman svara på extracellulära osmotisk stress innan cellen utlöses för att genomgå exocytos, andra kompletterande analytiska metoder kan användas för att berika denna information. Exempelvis för att undersöka om osmotisk stress förändrar vesikler volym, kan transmissionselektronmikroskopi (TEM) imaging analys användas att mäta vesikler storleken på celler efter kemiska fixering. För att undersöka om osmotisk stress påverkar vesikler kvantfysikaliska storlek, en nyligen utvecklad amperometrisk teknik som kallas intracellulära elektrokemiska flödescytometri, kan tillämpas för kvantifiering av vesikler signalsubstansen innehåll på sekretoriska vesikler i deras infödda tillstånd när fortfarande är bosatta i cytoplasman i levande celler²⁶. I den intracellulära elektrokemiska flödescytometri tekniken, en nanotip cylindriska kolfiber elektrod infogas försiktigt i cytoplasman av levande celler och, genom att tillämpa en +700 mV-potential till denna elektrod (vs en Ag/Granulatfyllda referens elektrod), den katekolamin innehåll i blåsor kan kvantifieras genom påvisande av en redox nuvarande spike från enstaka blåsor kollidera, absorberande, och därefter stochastically spricker vid elektrod ytan och därmed släppa deras innehåll mot den elektrod ytan²⁶. Därav, i amperometrisk nuvarande kontra tid spårning, varje enstaka vesikel spricker händelse kan resultera i en nuvarande övergående och genom att integrera området i varje nuvarande spike, vesikler kvantfysikaliska storlek kan beräknas med Faraday´s lag.

Därför, genom att länka den kvantitativa informationen från vesikler storlek mätningar med TEM imaging tillsammans med vesikler kvantfysikaliska storlek analys, som registrerats av intracellulära elektrokemiska flödescytometri, vesikler neurotransmittorn koncentration kan också bestämmas. Detta tillåter vesikler karakterisering när celler utsätts för olika osmotiska förhållanden och ger en bättre överblick på hur blåsor kan svarar på extracellulära osmotisk stress i skedet före exocytos. Resultaten från att kombinera dessa metoder har visat att närvaro av extracellulära höga osmotiska trycket, blåsor krympa och justera deras kvantfysikaliska storlek och jämföra den kvantitativa uppgifter om de relativa förändringarna av dessa mätningar visar att samtidigt krymper justera blåsor deras innehåll och storlek att upprätthålla en konstant neurotransmittorn koncentration²⁴. Denna förståelse är alltså värdefullt i anslutning till de iakttagelser som gjorts på neurotransmitterfrigöraren i celler utsätts för osmotisk stress. I protokollen beskriver vi användning av dessa tre kompletterande metoder som tillåter karakterisering av hur sekretoriska vesikler i deras infödda miljö besvara extracellulär osmolalitet och effekterna av detta svar på exocytos processen. Förutom våra tidigare iakttagelser angående effekten av höga osmotiska trycket på exocytos²⁴presenterar vi ytterligare experiment som beskriver cellen återhämtning efter osmotiska chock och effekten av flera barium stimuli i chromaffin celler.

Protocol

1. cellkultur för nötkreatur Chromaffin celler som isolerats genom enzymatisk nedbrytning från binjurarna För att isolera chromaffin celler som samlats in från nötkreatur binjurarna, sterilisera du celler med 70% etanol lösningen. Putsa bort fett och bindväv med en skalpell. Ta bort blod, skölj adrenal venerna med Lockes lösning (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, hydroxietylstärkelse piperazineethanesulfonic syra (HEPES) 5,6 mM vid pH 7,4) som har varit Termostatstyrt till 37 ° C. At…

Representative Results

Vi beskriver här protokollet för hur kombinera TEM imaging tillsammans med två elektrokemiska metoder, kolfiber amperometry och intracellulära elektrokemiska flödescytometri, kan ge information som når en bredare syn som anspelar på effekten av extracellulära osmotiska trycket på sekretoriska vesikler och processen exocytos. Genom att jämföra representativa amperometrisk inspelningar av exocytos release på enstaka chromaffin celler använder den experimentella ställa in (visas i figur 1<…

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll och fördelarna med att kombinera tre kompletterande analytiska metoder för att analysera sekretoriska vesikler och exocytos processen att få en bättre förståelse för hur en fysisk kraft såsom osmotiska trycket kan påverka sekretoriska vesikler och processen exocytos i sekretoriska celler. Dessa metoder inkluderar kolfiber mikroelektrod amperometry, som är en etablerad metod för inspelning exocytos aktivitet, intracellulära elektrokemiska flödescytometri, som används för at…

Materials

NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB