Summary
I manuskriptet som, beskriver vi brugen af en gær-baserede fluorescens reporter analyse til at identificere blodlegemers involveret i menneskehandel og dræbe processer af den cytotoksiske en underenhed af plante toksin ricin (RTA).
Abstract
Bakteriel og plante A / B toksiner udnytte de naturlige menneskehandel veje i eukaryote celler for at nå deres intracellulære målet (r) i cytosol og i sidste ende dræbe. Sådanne A / B toksiner generelt består af en enzymatisk aktive Asubunit (fx, ricin toksin en (RTA)) og en eller flere celle bindende Bsubunit(s), som er ansvarlige for toksin binding til specifikke celle overfladen receptorer. Vores nuværende viden om, hvordan A / B toksiner er i stand til at effektivt berusende celler hjalp forskere til at forstå grundlæggende cellulære mekanismer, som endocytose og intracellulær protein sortering i højere eukaryote celler. Fra et medicinsk synspunkt er det ligeledes vigtigt at identificere store toksin smuglerruter finder passende behandling løsninger til patienter eller i sidste ende udvikle terapeutiske toksin-baserede programmer for kræftbehandling.
Siden genome-wide analyser af A / B toksin handel i pattedyrceller er komplekse, tidskrævende og dyrt, flere undersøgelser på A / B toksin transport har været udført i gær model organisme Saccharomyces cerevisiae. Trods mindre komplekse, grundlæggende cellulære processer i gær og højere eukaryote celler kan er lignende og meget ofte resultaterne af gær blive overført til pattedyr situationen.
Her beskriver vi en hurtig og nem at bruge reporter analyse for at analysere den intracellulære handel med RTA i gær. En væsentlig fordel ved den nye assay er mulighed for at undersøge ikke kun RTA retro-translokation fra det endoplasmatiske reticulum (ER) i cytosol, men snarere endocytose og retrograd toksin transport fra plasma membran ind på Skadestuen. Analysen gør brug af en reporter plasmid, der giver mulighed for indirekte måling af RTA toksicitet via fluorescens emission af grøn fluorescerende proteiner (NGL) efter i vivo oversættelse. Da RTA forhindrer effektivt indledningen af proteinsyntese ved 28S rRNA depurination, tillader dette assay identifikation af vært celle proteiner involveret i intracellulære RTA transport gennem påvisning af ændringer i fluorescens emission.
Introduction
Patienter lider af infektioner af toxin producerende bakterier udgør en alvorlig medicinsk og økonomisk byrde for hver sociale sundhedssystem, især da effektive terapeutiske behandlinger er stadig i høj grad mangler. At udvikle nye terapeutiske strategier, de komplekse forgiftning mekanismer af lægeligt relevante A / B toksiner som kolera toksin, shigatoksin eller ricin skal være fuldt forstået på det molekylære niveau baseret på romanen kraftfulde assays, der skal gennemføres.
I de seneste år, flere undersøgelser har forsøgt at analysere A / B toksin transport i gær og pattedyrceller ved hjælp af tidskrævende og omkostningstunge metoder såsom radioaktivt toksin mærkning1,2 samt siRNA-baseret screening nærmer sig3. I nogle tilfælde er toksin menneskehandel blevet visualiseret i vivo af Fluorescens mikroskopi efter kemiske og/eller genetisk kobling af individuelle toksin underenheder med fluorophores, quantum dots eller fluorescerende proteiner4,5. Desværre, sådanne ændringer ofte føre til inaktive og/eller ændrede naturlige egenskaber af toksiner. En anden elegant måde indirekte besvare en lang række videnskabelige spørgsmål er brugen af reporter systemer baseret på enzymer såsom lacZ, luciferase, eller fluorescerende proteiner (f.eks. normal god landbrugspraksis eller Discosoma sp. rødt fluorescerende proteiner ( dsRed)).
I dette manuskript, er en enkel protokol beskrevet som identificerer cellulære komponenter, der kræves til intracellulær transport af extracellularly anvendt RTA i S. cerevisiae. Dermed fungerer et fluorescens-reporter plasmid som indeholder en N-terminalen ER-import signal efterfulgt af normal god landbrugspraksis som et protein biosyntesen sensor, der indirekte måler RTA-medieret protein oversættelse hæmning af normal god landbrugspraksis fluorescens emission efter in vivo oversættelse6. I tilfælde at RTA endocytose og/eller intracellulære handel negativt (eller positivt) påvirkes i en særlig gær sletning mutant sammenlignet med wild-type, kan dette påvises gennem en stigning (eller fald) i normal god landbrugspraksis fluorescens emission6.
Hidtil har var alle metoder analysere RTA transport i gærceller begrænset til ER til cytosol retro-translokation proces af RTA. I sådan et kunstigt system udtrykkes RTA indeholdende en ER import signal fra en inducerbar promotor, hvilket resulterer i en selvmorderisk fænotype1,7. Selv om cellen bindende B-subunit af ricin mangler ligeledes i eksperimentel konfigurationen som beskrevet i dette manuskript, og således ikke fuldt ud repræsenterer naturlige situation af ricin holotoxin forgiftning8, toksin transport fra plasma membran gennem Golgi apparatet på skadestuen kan efterlignes nøje med denne roman assay. Interessant, viser de foreløbige resultater, der opnås i pilot-undersøgelse, at menneskehandel veje bruges af RTA afslører slående ligheder med ruten forgiftning af ricin holotoxin.
I sammendrag, kan den beskrevne metode bruges til at bestemme den specifikke rolle af valgte cellulære proteiner i RTA endocytose og handel med gær. Desuden, denne eksperimentelle setup kan nemt tilpasses andre ribosomet uvirksomme giftstoffer produceres og udskilles fra forskellige gær og bakteriearter zymocin eller shigatoksin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: En oversigt over generelle eksperimentelle arbejdsprocessen er afbildet i figur 1.
Forsigtig: RTA er stærkt giftige for mennesker. Sikkerhed lab tilladelse S2 (biosikkerhed niveau 2 tilsvarende) er nødvendig. Venligst bære handsker under hele forsøget.
1. Heterolog ekspression af hans markeret RTA i Escherichia coli
- Transformer E. coli celler med udtryk plasmidet pET24-RTA(hans) 6 eller tomme vektor pET24a(+) ved hjælp af standard elektroporation protokoller9,10. Celler, der indeholder den tomme plasmid tjene som en negativ kontrol.
- Efter valg af positive kloner på kanamycin-holdige (100 µg/mL) LB plader, podes celler, der indeholder RTA udtryk plasmid eller den tomme vektor i 5 mL LBkan medium (LB medium med 100 µg/mL af kanamycin) og inkuberes ved 37 ° C og 220 rpm i 24 timer.
- Supplement 1 L LBkan medium med 5 mL før kultur og inkuberes celler ved 37 ° C og 220 rpm, indtil cellerne har nået en OD600 af 0,8-1,0 (ca 3-4 h). Derefter reducere kultur temperatur på 28 ° C og forberede en 1 M af isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) stamopløsning i H2O.
- Fremkalde RTA udtryk af E. coli ved at føje IPTG til en endelig koncentration på 1 mM.
- Efter 3,5 timer ved 28 ° C og 220 rpm, høst celler ved centrifugering på 10.000 x g og 4 ° C i 10 min, vaske pellet to gange med 5 mL af binding buffer (500 mM NaCl, 10 mM imidazol og 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) på 10.000 x g og 4 ° C i 10 min og resuspend pellet i 5 mL binding buffer.
Bemærk: Protokol kan afbrydes midlertidigt i denne fase og celler kan opbevares ved 80 ° C i flere dage.
2. rensning af hans markeret RTA via affinitet kromatografi
- Der sonikeres celler på is ved hjælp af følgende protokol: 15 s puls (20 mikron), 30 s pause. Gentag dette trin fem gange.
- Centrifugeres celle lysate på 21.000 x g og 4 ° C i 15 min og filtrere supernatanten ved hjælp af en steril sprøjte filtersystem (0,2 µm porestørrelse).
Bemærk: Celle pellets af med held sonicated prøver viser gennemsigtig grænser. - Bruge en automatiseret renseanlægget udstyret med 5 mL Ni2 +-baseret affinitet kolonne for at rense hans markeret RTA fraktion fra den sterile-filtreret E. coli supernatanten. Generelt bruge en eluering hastighed af 1 mL/min og cool hele renseanlægget for at forhindre ikke-effektiv toksin bindende og tab af toksin aktivitet.
Bemærk: Parametre for effektiv RTA rensning er angivet i tabel 1. Se også Becker mfl. for yderligere information9.- Kort, Blandingen henstår kolonnen affinitet med 20 mL af binding buffer til at fjerne opbevaring bufferen. Anvendes sterile-filtreret supernatanten affinitet kolonne ved hjælp af en sprøjte.
- Kolonnen udvaskes med 25-35 mL af binding buffer til at fjerne de ubundne proteiner fra kolonnen. Udføre vask-trin indtil UV absorbans ved 280 nm er tæt på den oprindelige UV værdi.
- Elueres bundne RTA brøkdel i 20-35 mL eluering buffer (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) og hold prøve på ice (figur 2A og figur 2B).
Bemærk: Eluering af RTA brøkdel er præget af en stigning i UV absorption. Bemærk venligst at udelukkende indsamle denne fraktion for at forhindre forurening med uspecifikke bundne proteiner. - Bruge 20 µL af elueret prøver for at udføre Coomassie blå farvning11 eller Western blot analyse12,13 (valgfrit). Bruge primære anti-hans antistoffer (1:1, 000) og sekundære anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) til at registrere RTA og kontrollere prøven renhed (figur 3).
- Desalt elueret RTA brøkdel på en 5 mL udvanding kolonne og reagensglasset prøven i 0,8 M sorbitol.
- Erstatte kolonnen affinitet renseanlægget af kolonnen udvanding og først Blandingen henstår kolonnen med 20 mL af 0,8 M sorbitol.
- Anvende den eluted RTA fraktion til kolonnen via en sprøjte. Kolonnen udvaskes med 100 mL af 0,8 M sorbitol og elueres den afsaltede RTA brøk i en 15 mL tube, som UV-absorption begynder at stige (figur 2 c).
- Gemme den eluted RTA brøkdel ved 4 ° C.
Bemærk: Stop direkte RTA brøkdel prøveudtagning når konduktans øger for at undgå salt kontaminering. Parametre for den afsaltningsprocedure er angivet i tabel 1.
- Koncentrere elueret RTA brøkdel på 10.000 x g og 4 ° C i 30-180 min. ved hjælp af en 10 kDa cut-off spin kolonne til en afsluttende bind 1-2 ml og gemme prøve ved 4 ° C i 3-4 uger.
Forsigtig: Ikke fryse prøven siden frysning fører til en fuldstændig tab af RTA aktivitet. - Bestemme proteinkoncentration ved hjælp af en konventionel protein bestemmelse kit. Proteinkoncentration skal være i intervallet 1-1,5 mg/mL.
Bemærk: RTA tendens til at udfælde hvis protein er for høj (> 5 mg/mL).
3. gær Transformation og cellevæg fjernelse
- Omdanne wild-type eller valgte gær sletning mutanter med normal god landbrugspraksis reporter plasmidet pRS315-K28SP- normal god landbrugspraksis6 ved hjælp af standard lithium acetat transformation metoder14. Inkuber celler på leucin drop-out (d/o) glucose plader (2% glukose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfat, 0,17% gær Nitrogen Base (YNB) og 0.087% d/o mix uden leucin) ved 30 ° C i 2-3 dage for positive klon udvalg.
- Vælge 3 forskellige gær kloner fra hver plade og podes kloner i 100 mL af leucin d/o raffinose medium (2% raffinose, 0,5% ammoniumsulfat, 0,17% YNB og 0.087% d/o mix uden leucin) på 220 rpm og 30 ° C til OD600 = 1,0-2,0 (2-4 x 107 celler/mL).
Bemærk: Cellevækst for forskellige gær sletning stammer er forskellige. Overvåge OD600 via et spektrofotometer. - For at beregne OD600 værdier, Fortynd prøver at OD600 = 0,1-0,3 (1:5 og 1:10 fortyndinger) og måle OD600 i et spektrofotometer. Som reference, bruge H2O suppleres med det tilsvarende beløb i leucin d/o raffionose medium.
- Efter efterbehandling skridt 3.5, bland 4 µL spheroplasted 50 mL kultur med 496 µL spheroplasting buffer (ca. 2 × 106 spheroplasts) og centrifugeres i 10 min. ved 400 x g.
- Resuspend pellet i 10 mL H2O destilleret, vortex prøve for 30 s, og pladen ud 10 µL af prøven på leucin d/o glukose plader (2% glukose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfat, 0,17% YNB og 0.087% d/o mix uden leucin).
- Inkuber celler i 3 dage ved 30 ° C. Tælle det samlede antal vokset celle kolonier på pladen. For datavurdering, brug kun prøver med effektivitet højere end 98% (total celle koloni antallet < 40 kolonier/plade).
4. normal god landbrugspraksis Reporter Assay måling i 96-brønd plader
- Frø ud gær celle spheroplasts fremstillet i trin 3.7 i 96-brønd plader (200 µL/brønd).
- Tilføje 70 µL stabiliseret leucin d/o raffinose medium indeholdende negativ kontrol (eluatet af en Ni2 +-affinitet renset celle lysate fra IPTG-induceret E. coli celler, der udtrykker den tomme vektor) eller renset RTA i en endelig RTA koncentration på 5 µM ( svarende til 160 g/L RTA) i hver brønd.
- Straks tilføje 30 µL stabiliseret galactose løsning (30% galactose, 0,8 M sorbitol) for at fremkalde normal god landbrugspraksis udtryk og efterfølgende starte målingen.
Bemærk: Udfører mindst 3 tekniske replikater pr. eksperiment og 3 biologiske replikater pr. gærstamme. - Efter endt Prøveforberedelse (trin 4.1-4.3), sætter 96-brønd pladen i et fluorescens læser og start måling. Bruge 475/509 nm filter sæt nødvendige for normal god landbrugspraksis fluorescens påvisning. Udfør målinger ved 30 ° C, 120 rpm, og med en rystende diameter 1 mm over et tidsvindue på 20 h (måling med 10 min mellemrum).
Bemærk: Normal god landbrugspraksis filtersæt er normalt tilgængelige i alle læser systemer. Temperatur, tidsvindue, måling af intervaller og RTA koncentration kan justeres til egne behov. Repræsentative resultater er vist i figur 4. - Valgfrit: Brug yderligere interne kontroller i målingen for kvalitetskontrol. Forbered en negativ kontrol ved at tilføje 30 µL stabiliseret leucin d/o raffinose medium i stedet for 30% galactose (ingen normal god landbrugspraksis induktion). Derudover tilføje 70 µL af 0,8 M sorbitol stabiliseret G418 løsning (300 µg/mL). Protein oversættelse hæmmer G418 fungerer som positiv kontrol for protein hæmning som det forhindrer normal god landbrugspraksis udtryk i gær.
- Beregne relativ normal god landbrugspraksis fluorescens i procent for 20 h tidspunkt efter følgende ligning (jf. figur 4A):
hvor NC er den negative kontrol
- Alternativt kan du bestemme den relative normal god landbrugspraksis fluorescens for hvert målepunkt (i dette tilfælde 10 min, se også trin 4.4) ved hjælp af ovenstående ligning. Som vist i figur 4B, oprette et diagram ved at duppe normal god landbrugspraksis fluorescens intensiteter (y-aksen) over tid (x-akse).
hvor NC er den negative kontrol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle arbejdsgang af den protokol, der er beskrevet i dette håndskrift er illustreret i figur 1, groft sammenfatter enkelt trin til vellykket RTA rensning og efterfølgende normal god landbrugspraksis reporter assay eksperiment. En mere detaljeret beskrivelse af hvert enkelt trin kan findes i protokollen. Figur 2 illustrerer det forventede resultat af en vellykket RTA rensning af affinitet kromatografi (figur 2A) og Tom vektor kontrol (figur 2B). Figur 2 c viser et repræsentativt resultat af en udvanding eksperiment illustrerer den ideelle adskillelse mellem protein peak (blå) og salt-elueres peak (brun). En effektiv RTA rensning er præsenteret i form af en Coomassie farvede SDS-gel i figur 3. Endelig, figur 4 opsummerer nogle oprindelige resultaterne af denne enkle og robuste normal god landbrugspraksis-baserede reporter assay metode6. Figur 4A illustrerer at etablerede normal god landbrugspraksis reporter analysen er i stand til at producere pålidelige resultater og skematisk skildrer normal god landbrugspraksis reporter plasmid brugt i denne undersøgelse. I grafen, er den relative normal god landbrugspraksis fluorescens af gær spheroplasts RTA-behandlede og ubehandlede betingelser i forhold til hinanden. Som forventet, viser ikke-induceret samt G418-behandlede celler næsten ingen normal god landbrugspraksis fluorescens. I ubehandlede og negativ kontrol-behandlede (Tom vektor) celler, normal god landbrugspraksis udtryk påvirkes ikke og betydelige forskelle mellem begge prøver ikke blev overholdt. Derimod fører RTA behandling til den forventede normal god landbrugspraksis fluorescens reduktion medieret af dens ribosomet hæmmende aktivitet. I figur 4Bvises en gang kurve af RTA-induceret NGL fluorescens hæmning. Denne form for præsentation af data indeholder yderligere oplysninger om timingen af normal god landbrugspraksis udtryk (90 min efter galactose induktion) og udgangspunktet for Translationel hæmning af RTA (210 min efter ansøgning i wild-type celler). Forsinkelsen i RTA-medieret fluorescens fald sandsynligvis afspejler optagelse kinetik og intracellulær transport af RTA til cytosol. Figur 4 c illustrerer den relative normal god landbrugspraksis fluorescens fremstillet af udvalgte gær mutanter efter en 20 h RTA-behandling og i forhold til RTA-behandling og i forhold til RTA-behandlede wild-type celler. ERAD komponenter Hrd1p og Der1p blev valgt som velegnet positiv kontrol fordi tidligere undersøgelser allerede demonstreret at begge proteiner er involveret i ER til cytosol retrotranslocation af RTA i gær1. Derfor viser begge mutanter den forventede stigning i normal god landbrugspraksis fluorescens i forhold til wild-type celler. Derimod er relativt normal god landbrugspraksis fluorescens værdier i Δyos9 og Δnup120 celler ikke signifikant forskellig. Det er allerede blevet beskrevet, hverken en manglende ER kvalitetskontrol lektin Yos9p eller en mangel i den nukleare pore protein Nup20p påvirker RTA toksicitet og transport1. En liste over de specifikke affinity kromatografi og afsaltning parametre kan findes i tabel 1.
Figur 1: generel workflow RTA rensning og normal god landbrugspraksis-baserede reporter assay. RTA rensning (venstre) starter med transformation af E. coli med udtrykket eller tomme vektor efterfulgt af dyrkning og IPTG-induceret RTA udtryk. Efter celle lysis og steril-filtrering, supernatanten er renset via Ni2 + affinitet kromatografi og prøve renhed kontrolleres via Coomassie farvning eller vestlige skamplet. Før de eluted RTA fraktioner er klar til brug i normal god landbrugspraksis reporter assay eksperiment, brøker skal afsaltes og koncentreret, og proteinkoncentration bestemmes. Normal god landbrugspraksis reporter assay eksperiment (til højre) begynder med omdannelsen af wild-type og/eller valgte gær sletning mutanter med normal god landbrugspraksis udtryk konstruktion. Efter dyrkning fjernes cellevæggen ved enzymatisk behandling tillade RTA i vivo optagelse. Derefter normal god landbrugspraksis fluorescens af gær celle spheroplasts måles under toksin-behandlede og ubehandlede forhold over tid i et fluorescens læser (475/509 nm). Endelig, relativ normal god landbrugspraksis fluorescens bestemmes ved hjælp af ligningen vist taktfast 4.6 og vises som illustreret i figur 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative affinitet kromatografi og afsaltning resultaterne af E. coli celler, der indeholder pET-RTA(hans) 6 eller tomme vektor kontrol. (A) typisk rensning graf af en E. coli celle lysate prøve at udtrykke RTA(hans) 6 fra vektor pET24-RTA(hans) 6. Blå kurve repræsenterer UV-absorption på 280 nm forårsaget af de aromatiske ringe af aminosyrer Trp, Tyr og Cys og fungerer som protein indikator. Under kolonnen lastning, er ubundne proteiner fundet i flow-gennem (0-10 mL). Efter at fjerne ubundne proteiner ved at vaske med binding buffer, eluering buffer koncentration er steget fra 0 til 100% (rød kurve) og bundne proteiner er straks elueres af kolonnen. Toppen af den blå kurve mellem 25 og 30 mL repræsenterer brøkdel af bundne hans markeret RTA (sort boks). (B) typisk rensning graf af en E. coli lysate fra celler, der udtrykker Tom vektor kontrol. Samme rensning protokol som i (A). Som vist i den sorte boks, er ingen proteiner elueret fra kolonnen i den negative kontrol. (C) Desalting diagram af en E. coli pET24-RTA(hans) 6 stikprøve efter affinitet rensning. Diagrammet viser adskillelse af RTA proteinfraktion (peak på 280 nm absorption mellem 20-30 mL) og salt brøkdel (stigende ledningsevne peak efter 30 mL).Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant Western analyse af forskellige prøver før og efter rensning med affinitet. 20 µL celle lysate (baner 2-4) eller renset prøve (baner 5-7) af forskellige RTA varianter (kun umodificeret RTA blev brugt i denne undersøgelse) analyseret af SDS-PAGE og Coomassie blå farvning. Lane 1, protein stigen; Lane 2, uforandret RTA; Lane 3, RTAHDEL; Lane 4, RTAKDEL; Lane 5, uforandret RTA; Lane 6, RTAHDEL; Lane 7, RTAKDEL. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: opnås repræsentative resultater af reporter assay for RTA-behandlede vildtype og valgte gær sletning mutanter. (A) relativ normal god landbrugspraksis fluorescens af vildtype gær spheroplasts indeholdende reporter plasmidet pRS315-K28SP- normal god landbrugspraksis (til højre) under induceret (3% galactose, GFPind.) og ikke-induceret (2% raffinose, GFPrepr.) betingelser efter 20 h normal god landbrugspraksis induktion. Relativ normal god landbrugspraksis fluorescens blev også analyseret i overværelse af RTA (5 µM), G418 (300 µg/mL) eller den negative kontrol (NC). Protein oversættelse hæmmer G418 fungerer som positiv kontrol og forhindrer normal god landbrugspraksis udtryk i gær. Middelværdier og standardafvigelse (SD) er angivet. (B) relativ normal god landbrugspraksis fluorescens fra (A) vises som tidsforløb over 20 h. Dette diagram giver yderligere oplysninger om timingen af normal god landbrugspraksis udtryk og oversættelse hæmning af RTA; kurven adfærd afspejler indirekte kinetik af RTA optagelse og intracellulære transport til cytosol. (C) repræsentative resultatet af valgte gær mutanter defekt i cellulære proteiner, der er kendt for at være involveret (Hrd1p og Der1p) eller ikke involveret (Yos9p og Nup120p) i RTA menneskehandel gær1,6. Den prikkede linje repræsenterer en tærskel på betydning, som er baseret på fluorescens emission fremstillet ved positiv kontrol stammer (for yderligere forklaring Se reference6). Middelværdier og standardafvigelse (SD) er angivet. Tallet blev ændret fra Becker et al. 6 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Affinitet gaskromatografi parameter | ||
| Måling af parametre | UV (280 nm), eluering buffer koncentration, ledningsevne | |
| Indstillinger | Variabel/enhed | Værdi |
| Strømningshastighed | mL/min | 1 |
| Maksimale tryk | MPa | 0,35 |
| Bølgelængde | nm | 280 nm |
| Binding buffer | Pumpe position | A |
| Eluering buffer | Pumpe position | B |
| Start koncentration eluering buffer | % | 0 |
| Systemet volumen kompensation | mL | 10 |
| Kolonne ækvilibrering | mL | 20 |
| Prøven injektion over superloop/sprøjte | mL | lysate cellevolumen |
| Vask trin | mL | 20-35 |
| Eluering trin | mL | 20-35 |
| Koncentration eluering buffer under eluering | % | 100 |
| Rekalibrering af kolonne med 20% EtOH | mL | 50 |
| Afsaltning parameter | ||
| Måling af parametre | UV (280 nm), ledningsevne | |
| Indstillinger | Variabel/enhed | Værdi |
| Strømningshastighed | mL/min | 4 |
| Maksimale tryk | MPa | 0,35 |
| Bølgelængde | nm | 280 nm |
| Binding buffer | Pumpe position | A |
| Eluering buffer | Pumpe position | B |
| Start koncentration eluering buffer | % | 0 |
| Systemet volumen kompensation | mL | 10 |
| Kolonne ækvilibrering | mL | 20 |
| Prøven injektion over superloop/sprøjte | mL | lysate cellevolumen |
| Afsaltning buffer injektion (0,8 M sorbitol) | mL | 100 |
| Rekalibrering af kolonne med 20% EtOH | mL | 50 |
Tabel 1: parametre anvendes til kolonne-baserede affinitet rensning og afsaltning. Liste over alle relevante Kolonneindstillinger (fx, flow, eluering buffer koncentration, ækvilibrering og vask trin varighed) og målte parametre (f.eks., ledningsevne eller UV absorption).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du udfører den ovennævnte protokol, anbefaler vi følgende forslag til at opnå et vellykket resultat af forsøget.
For heterolog protein udtryk er det vigtigt at ikke overstige IPTG koncentration af 1 mM. IPTG koncentrationer > 1 mM hæmme promotor-induceret RTA udtryk og fører til lavere toksin udbytter. Desuden bør celler ikke være dyrket ved temperaturer højere end 28 ° C at forhindre inklusion krop dannelse, ineffektive foldning og toksin inaktivering. RTA udtryk ved lavere temperatur (f.eks., 20-28 ° C) er muligt og også fører til fremstilling af biologiske aktive giftstof. Imidlertid yderligere temperatur reduktion væsentligt forbedrer ikke RTA aktivitet/foldning og resulterer i en lavere samlet toksin udbytte i forhold til 28 ° C (data ikke vist).
Rensning parametre af affinitet kromatografi (tabel 1) er optimeret til anvendelse af en automatiseret renseanlægget udstyret med 5 mL Ni2 + affinitet kolonne og tilpasses til andre hjemmelavede eller kommercielle kolonne systemer, hvis RTA renhed og udbyttet er optimale. I tilfælde af sub-optimale RTA renhed (angivet af udseendet af ekstra proteiner i Coomassie farvede SDS-geler), en stigning i imidazol koncentration af den bindende buffer normalt reducerer uspecifik binding af positivt ladede proteiner til den kolonne, derved øge samlet RTA renhed. I tilfælde af sub-optimale RTA udbytter, indførelsen af yderligere sonification trin (4-8 bælgfrugter), længere inkubation times (5 h) eller større kultur diskenheder (> 1 L) kan bidrage til at forbedre den overordnede toksin udbytte. Men der er også mulighed for at med held rense RTA via spin kolonne baseret systemer (data ikke vist) Hvis et automatiseret system ikke er tilgængelig i laboratoriet.
Under trinnet udvanding er det vigtigt at springe prøveudtagningsproceduren, så snart ledningsevne begynder at stige. Forurening med salt, især imidazol, påvirker koncentrationsmåling protein, hvilket resulterer i unøjagtige RTA koncentration bestemmelse, som direkte påvirker RTA indhold bruges i normal god landbrugspraksis reporter assay.
Det er vigtigt at gemme renset RTA ved 4 ° C og undgå frysning. Frosne prøver viser en nedsat aktivitet på RTA i XTT-baserede celle vitalitet assays på HeLa celler (data ikke vist). Renset prøver kan opbevares i ca 3-4 uger før deres biologiske aktivitet kontinuerligt mindskes. Derudover er høje RTA koncentrationer (≥5 mg/mL) efter spin kolonnen koncentration kritisk, fordi RTA viser en tendens til at udfælde i 0,8 M sorbitol.
En ulempe ved metoden er, at RTA er normalt ikke tages af intakt gærceller. For at opnå pålidelige resultater, skal gærcellemembraner fjernes helt ved enzymatisk behandling. Derfor er det absolut nødvendigt at kontrollere spheroplast dannelse effektivitet af hver gærstamme af metoderne i trin 3.4-3.5. I tilfælde af sub-optimale spheroplast forberedelse, bør inkubationstiden og lytisk enzym koncentration optimeret og overvåges via fase kontrast mikroskopi. Overdigestion (ghost dannelse) kan forebygges ved at reducere lytisk enzym koncentration og/eller inkubation tid, mens den modsatte tilgang er nødvendig i tilfælde af utilstrækkelig fordøjelsen. Data fra stammer med utilstrækkelig cellevæg fjernelse bør udelukkes fra data evaluering.
Det bør også nævnes, at opsætningen af eksperimenterende ikke helt efterligner den naturlige forgiftning proces af ricin. Celle bindende B underenhed af ricin (RTB) mangler, som er normalt ansvarlig for effektiv toksin binding til galaktose rester på celleoverfladen pattedyrceller15. Teoretisk, denne begrænsning kan overvindes ved at udføre eksperimentet med renset ricin holotoxin indeholdende dens A- og B-underenhed. Ikke desto mindre besidder gærceller ikke galactose rester på deres celleoverfladen, som kunne mægle binding af RTB8; Dette faktum forklarer også, hvorfor intakt gærceller er ikke følsomme mod ricin. Derfor er det uklart, om RTB ville fungere som celle bindende komponent i modellen gær. Interessant, demonstreret tidligere undersøgelser allerede at RTA er købedygtig nå til cytosol af pattedyrceller uden sin celle bindende B subunit16. For at forstå dette fænomen, besluttede vi at bruge kun RTA i opsætningen af eksperimenterende for at identificere cellulære komponenter i gær, som lette toksinvåben handel fra plasma membran ind i cytosol. Overraskende, viser de involverede i RTA menneskehandel gær komponenter slående ligheder til de komponenter, der kræves til effektiv ricin holotoxin transport i pattedyrceller6. Baseret på disse resultater, kan det være spekuleret at RTB spiller en mindre rolle i intracellulære ricin transport end tidligere antaget og er kun vigtigt for den første kontakt til pattedyr cellens overflade.
Derimod siRNA-baserede systemer i pattedyrceller perfekt afspejler den naturlige toksin situation, men er tidskrævende og dyrt3. Desuden brug af gær sletning mutanter, bærer den vigtige fordel mutanter viser en komplet knock-out af protein af interesse, der henviser til, at siRNA-baserede systemer generelt føre til en reduktion af protein niveauet. I nogle tilfælde, kan resterende protein niveauer være tilstrækkelige for toksin transport hvorved ingen ændrede fænotype er observeret og inddragelse af den specifikke protein er således, ikke synlige i siRNA-baserede systemer.
Selv om sletning kun ikke-væsentlige gærstammer blev brugt i oprindelige undersøgelse6, temperatur-følsomme stammer samt nedsat overflod af mRNA undertrykkelse af netbårne (fugtig) samling stammer17 (nedsat udtryk niveau af væsentlige proteiner) er ligeledes velegnet til denne form for metode i fremtiden. Generelt rollen som væsentlige proteiner kan ikke blive undersøgt med denne analyse på grund af deres manglende levedygtighed, udgør derfor en begrænsning af assay system.
Men den nye reporter assay repræsenterer en elegant og alternative strategi til eksisterende metoder, som forsøger at analysere RTA transport i model organisme S. cerevisiae. De eksisterende undersøgelser anvendes intracellulære plasmid-drevet RTA udtryk systemer og er begrænset til analyse af retro-translokation fra Skadestuen i cytosol1,7. Vellykket gennemførelse af ekstracellulære RTA programmet nu åbner mulighed for at studere ikke blot ER retrotranslocation, men også indirekte analysere RTA transport fra PM i Golgi på skadestuen.Som cellefunktion og lokalisering af fleste af gær gener er i dag opdaget og tilgængelige i databaser, identificeret kandidat proteiner kan tildeles direkte bestemt rum og/eller transport veje.
Samlet set repræsenterer metoden indført reporter assay en let og robust tilgang til at identificere kandidat proteiner involveret i intracellulære handel af toksiner eller toksin underenheder (fxRTA) som blokere protein oversættelse i vivo. Forholdsvis lav standardafvigelser (1-10%) samt høj data reproducerbarhed i den oprindelige undersøgelse bekræfter disse opgørelser. På grund af formatet 96-brønd plade er en hurtig screening for forskellige gær mutanter muligt inden for en dag efter toksin rensning.
Fremover er der mulighed for at bruge metoden til high throughput screening af gær sletning biblioteker. I den aktuelle opsætning er anvendt RTA koncentrationen (5 µM) i stand til at mindske den relative normal god landbrugspraksis fluorescens til 50%. Under disse omstændigheder er har metoden fordelen for at identificere sletning mutanter med negative (øget normal god landbrugspraksis fluorescens) og positivt (nedsat normal god landbrugspraksis fluorescens) virkninger på RTA transport. For høj overførselshastighed screeninger er en stærkere forskellen mellem behandlede og ubehandlede prøver undertiden gavnlig. Ved hjælp af højere RTA koncentrationer og/eller øge foranstaltning interval (fx, 48 h), bør en endnu mere udtalt blok af normal god landbrugspraksis udtryk være opnåelige.
Det må understreges, at denne metode ikke er kun begrænset til at analysere forgiftning proces af ekstracellulære anvendt RTA i gær, men der er også mulighed for at analysere ER import af RTA udtrykke RTA en plasmid i denne normal god landbrugspraksis reporter stamme (data ikke vist). Screening tilgang kan endvidere ligeledes tilpasses for at studere intracellulær transport veje af andre proteinsyntese, hæmme proteiner som zymocin18 i fremtiden. I modsætning til tilstanden godt karakteriseret drab i zymocin er relativt lidt kendt om menneskehandel veje ansvarlig for effektiv toksin transport i cytosol19,20. Dermed, repræsenterer zymocin en optimal kandidat til fremtidige undersøgelser som zymocin er naturligvis taget af gærceller. Således, fjernelse af cellevæggen kan udelades, som forbedrer den generelle ydeevne af normal god landbrugspraksis reporter analyse (med hensyn til tid og omkostninger). Ved hjælp af dette kraftfulde reporter assay, ville det være muligt at dissekere intracellulær transport helbredsbaseret af zymocin i gær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dele af denne undersøgelse blev venligt støttet af en bevilling fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
