単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム
Summary
ここでは、乳癌、がん細胞同様単球とコラーゲン分解、免疫細胞の動員、セルなど成果の直接的/間接的相互作用の研究としての形態を分析する三次元培養法について述べる侵略、および炎症の癌関連のプロモーション。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) に埋め込まれている正常および腫瘍性上皮細胞は密接に従って大きく正常組織の恒常性と病気の結果に影響を及ぼす造血および非造血細胞と通信します。乳がん、腫瘍関連マクロファージ (Tam)、病気の進行、転移, 再発形式に重要な役割を果たすしたがって、単球より腫瘍微小環境と腫瘍細胞との相互作用のメカニズムを理解することは、病気をコントロールすることが重要です。ここでは、我々 はひと乳癌 (BrC) 細胞およびひと単球の三次元 (3 D) 共培養システムの詳細な説明を提供します。BrC 細胞生産規制活性化の高い基底レベル、通常 T 細胞表現 (RANTES) を分泌、単球走化性因子蛋白質 1 (MCP-1)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (G-CSF)、単球との共培養中炎症性サイトカイン インターロイキン (IL)-1 β (il-1) 及び il-8 はマトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-1、MMP 2、MMP 10 と濃縮しました。この腫瘍間質の微小環境推進アノイーキス mcf-10 a 3 D 腺様構造、単球のより、積極的な BrC 細胞の侵入への抵抗です。ここに示すプロトコル内腫瘍通信を勉強する経済的な代替手段を提供、腫瘍に関連する腫瘍生物学の特定の機能を問い合わせるに 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の例侵略。
Introduction
腫瘍生物学は以前考えられていたよりもはるかに複雑です。がん細胞が、単なる一括制御不能な増殖細胞のより多くを示しています証拠むしろ、異なる腫瘍細胞は高い組織と腫瘍1内の階層を表示するさまざまな機能を実行するようです。腫瘍細胞は、細胞の非変形と親密なコミュニケーションも: マクロファージ、線維芽細胞、リンパ球、脂肪細胞、血管内皮細胞は、他のセルの間ですべての没頭している足場蛋白質および ECM を構成する多糖類。多数の直接的および間接的な相互作用は、トランス フォームおよび非変形細胞と疾患の結果2,3以上の強力な影響力を発揮する ECM に確立されます。BrC の特定のケースでは、Tam、4, 再発・転移のリスクを増加させる, 腫瘍の進化に重要な役割を果たすため、Tam が発見されていることを考慮した BrC 細胞のコミュニケーションを分析するが特に重要です。 ,5。
内腫瘍の相互作用とその結果を分析する、新しい 3 Dの in vitroアプローチがはるかに複雑な微小環境を提供する ECM エキスの使用に基づいて開発されているとの比較で、腫瘍生物学の現実に近い従来の単層培養細胞が増えるは、プラスチックに接続されています。ピーターセンとビッセル6提供悪性の最初のモデルと悪性の乳腺上皮細胞ラミニン豊富な基底膜上で培養した悪性の人間を差別する 3 D 脊髄構造を記述する第 1 だった乳腺上皮細胞悪性の対応。10 年後、Debnath、Muthuswamy、によって開発されたモデルとブルージュ7,8,9悪性腺房の中に危険生物学的経路を解明する貴重なツールの提供など制御不能な増殖、腺腔アノイーキス、セル抵抗の結果としての損失と障害細胞の極性形成の証拠としてタイト結合蛋白質の非局在化による大きな腺形成としてプログラムされた細胞死の種類で発生します。付着依存性細胞周囲の ECM から切り離す。Sameni モデル、Jedeszko、スローンは侵襲, 腫瘍悪性腫瘍10、11,12のもう一つの重要な特徴に関連して細胞イメージングのプロテアーゼ活性に焦点を当てています。これらのモデルは異なる蛍光焼蛋白基質と混合タンパク質行列に依存 (DQ ゼラチン、DQ コラーゲン I と DQ コラーゲン IV)、蛍光信号のコラーゲンの分解を示唆しています。3 D モデルは非変形両方の茎セルのプロパティ、セルの集計、また呼ばれる回転楕円体の腫瘍細胞を研究にも使用され、懸濁液または非対称細胞分化のメカニズムに対する尋問 ECM のようなタンパク質では培養することができます。細胞分裂、細胞間付着、細胞運動13,14。浸潤アッセイは、腫瘍の本質的な攻撃性と侵襲的プロセス15中走化性因子として機能する分子の同定をテストできるようにします。全体としては、3 D モデルは、通常、発癌性の組織形態をより密接に反映の in vitro細胞培養の手頃な多様化を表します。
我々 は両方の人間商業 BrC 知られている積極的なポテンシャル (内腔・ トリプル ネガティブ タイプ)、プライマリの細胞ラインを使用して前述のモデル7,10,11に基づく 3 D 細胞培養システムを設計しています。BrC 患者から仔のセルです。我々 はまず非積極的な (MCF-7) または積極的な (MDA-MB-231) BrC 細胞が細胞外マトリックス抽出物 (ECME) U937 単球との共培養モデルを開発-ベースの 3 D システム直接細胞相互作用を許可します。これらの共培養は、一連のがんの積極的な行動に関わる遺伝子の転写に影響を与えたこれら 2 つの細胞系譜の間の通信を決定するために使用されました。1 つの製品、プロスタグランジン E2 (PGE2) 炎症癌の進行に於いての役割を強調表示されます見つける増産と一致するシクロオキシゲナーゼ 2 (COX-2) 成績証明書の大幅な増加が観察されました。MMP の高められたトランスクリプションが積極的な MDA MB 231 細胞共同 DQ コラーゲン IV を含む文化の U937 単球培養したときよりコラーゲン分解と相関が認められました。注記のうち、私たちの共培養したコラーゲン分解の細胞間相互作用メカニズムが必要であると仮定をサポートしていません。むしろ 2 つセル血統間の通信は分泌された分子によって調停されるようお勧めします。さらに、これらの共同培養の試金から収穫される清には13未変換 mcf-10 a の細胞によって形成された腺房を解体可溶性因子が含まれています。積極的なことが分かったし、分泌される主の BrC 細胞単球走化性分子 MCP 1、GM-CSF と RANTES の上昇します。したがって、我々 は細胞が細胞間相互作用を防ぐために細胞文化の挿入に分けられた 3 D 文化概説。これらの文化は、BrC 細胞と単球の間の間接的な通信に対処するために使用されました。これらの試金、非積極的かつ積極的な商業 BrC 細胞と初代の BrC 細胞ひと単球の 3 種類に: 商業 U937 と THP 1 セル、およびプライマリ単球 (PMs) (すべて健康なドナーの末梢血から分離しました。単球は非活性化状態で使用されていた) に使用されました。共同文化の豊かさに炎症性サイトカイン il-1 と IL-8 の濃度の増加が認められました。同様に、MMP 1、MMP-2、および MMP 10 も BrC 細胞単球共培養、およびこうして補強前調査結果14に増加したことがわかった。本稿では、プライマリの BrC 細胞分離および 3 D 培養テストのポイントによってワークフローは代表の結果と一緒に提示されます。この作品は、腫瘍生物学の特定の側面を調査する 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の良い例を構成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
上皮細胞 3 D 空間構造の成長し、ECM 蛋白質との相互作用は組織の恒常性のため極めて重要です。細胞膜 (2 D) の成長の多くのがん研究に基づいているし、単分子膜が ECM に課す、細胞の特性を要約しない彼らは腫瘍の形成および進行の多くの側面を理解する重要なされているが、インスタンス:増殖、接着依存性細胞の生存、頂基底極性、ECM を改造、細胞分化などを制限します。重要な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、CONACyT FONSEC SSA、IMSS、ISSSTE プロジェクト号 233061 エセキエル ・ m ・ フエンテス-Pananá、フォンド ・ デ ・ Apoyo 危惧、病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメス (プロジェクト番号 HIM-2014-053) アラカルトにサポートされていました。・ エスピノーザ サンチェス NA は、プログラム ・ デ ・ Doctorado en 芸術 Biomédicas、大学国立自治・ デ ・ メヒコ (UNAM) と CONACYT から受信した交わり 231663 から博士課程の学生です。E S NA、また社会保障 (IMSS) のメキシコ協会によって提供される財政支援を認めます。
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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