Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı
Summary
Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.
Abstract
Hücre dışı Matriks (ECM) gömülü, normal ve neoplastik epitel hücreleri hematopoetik ve sigara hematopoetik hücreler ile böylece büyük ölçüde etkileyen normal doku homeostazı ve hastalık sonucu yakından iletişim kurmak. Meme Kanserinde tümör ilişkili makrofajlar (TAMs) hastalık ilerlemesi, metastaz ve yineleme kritik bir rol oynamaktadır; Bu nedenle, monosit chemoattraction tümör microenvironment ve tümör hücreleri ile onların etkileşim mekanizmaları anlama hastalık kontrol etmek önemlidir. Burada, insan meme kanseri (BrC) hücreleri ve insan monosit üç boyutlu (3D) ortak kültür sistemi ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. BrC hücreler üretilen düzenlenmiş etkinleştirme üzerinde Bazal düzeyi yüksek, normal T hücreli ifade ve (RANTES) salgılanan, monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (G-CSF), monosit ile ortak kültür iken Pro-inflamatuar sitokinlerin İnterlökin (Il) -1 beta (IL-1β) ve Il-8 matriks metalloproteinazların (MMP) -1, MMP-2 ve MMP-10 ile birlikte zenginleştirilmiş. Bu tümör stroma microenvironment direnci anoikis MCF-10A 3D acini benzeri yapıları, monosit chemoattraction ve agresif BrC hücreleri işgali için terfi. Burada sunulan protokollerini Intra-tümör iletişim çalışmaya uygun fiyatlı alternatif sunmak ve tümör biyolojisi tümör için ilgili belirli özellikleri sorgulamaya vitro 3D hücre sistemleri sağlar büyük potansiyel bir örnektir saldırganlık.
Introduction
Tümör biyolojisi önceden tahmin ettiğimden çok daha karmaşık. Montaj kanıt tümör hücreleri daha fazla sadece bir kontrolsüz Proliferasyona hücrelerinin daha toplu gösterir; Bunun yerine, farklı neoplastik hücreler yüksek organizasyon ve hiyerarşi içinde tümör1görüntüleme farklı işlevleri yerine görünmektedir. Tümör hücreleri dönüştürülmüş olmayan hücreleri ile samimi iletişim de bulunmaktadır: makrofajlar, fibroblastlar, lenfositler, adipositler, endotel hücreleri, diğer hücreler arasında tüm iskele proteinler ve ECM teşkil polisakkaritler daldırılır. Çok sayıda doğrudan ve dolaylı etkileşimleri dönüştürülmüş ve sigara dönüştürülmüş hücreler arasında ve hastalık sonucu2,3üzerinde güçlü bir etkisi giderek artan ECM ile kurulur. BrC belirli olması durumunda, bu TAMs TAMs tümör gelişiminde önemli bir rol oynamaya metastaz ve4 hastalık Rekürrens riski artan bulunmuştur ki göz önünde bulundurarak, BrC hücrelerle iletişim incelemek özellikle önemlidir ,5.
İçi tumoral etkileşimleri ve onların olası sonuçlarını çözümlemek için yeni 3D vitro yaklaşımlar temel alınarak çok daha karmaşık bir microenvironment sağlamak ECM özleri kullanımı geliştirilmiştir tümör biyolojisi, karşılaştırma için gerçeğe daha yakın hangi hücrelerin büyümesine geleneksel monolayer hücre kültürleri için plastik bağlı. Petersen ve Bissell6 nonmalignant ilk modeli sağlanan ve malign meme epitel hücreleri kültürlenir laminin zengini bir membran üzerinde ve nonmalignant insan ayırımcılık 3D organotypic yapılarını açıklamak için ilk idi meme Malign karşılıklarından epitel hücreleri. On yıl sonra model Debnath, Muthuswamy, geliştirilen ve Brugge7,8,9 sağlanan glandüler acini, malign transformasyon sırasında tehlikeye biyolojik yollar aydınlatmak için değerli bir araç gibi büyük acini oluşumu nedeniyle kontrolsüz çoğalması, Engelli hücre polarizasyon kanıtı ve acini Lümen sonucu olarak anoikis, hücre direnç kaybı olarak sıkı kavşak proteinlerin delocalization olarak programlanmış hücre ölümü bir tür içinde oluşur Onlar çevreleyen ECM ayırdığınızda anchorage bağımlı hücreleri. Sameni, Jedeszko ve Sloane modellerinin invasiveness, tümör habis10,11,12başka bir önemli özelliği olan NBD’ye çok görüntüleme proteolitik aktivite hücreler tarafından üzerinde odaklanmıştır. Protein matrisler farklı floresan söndürülür protein yüzeyler ile karışık bu modeller itimat (DQ-jelatin, DQ-kollajen ı ve DQ-kollajen IV), hangi floresan sinyallerini kollajen proteolitik bozulması işaret etmektedir. 3D modelleri Ayrıca kök hücre özellikleri her iki sigara dönüştürdü ve tümör hücreleri, hangi hücreye toplamları, ayrıca olarak adlandırdığı pulcuklarının incelemek için kullanılır, süspansiyon veya ECM gibi proteinler hücre farklılaşması, asimetrik mekanizmaları için sorguya kültürlü olabilir hücre bölünmesi, hücre hücre bağlılık ve hücre hareketliliği13,14. İstila deneyleri sırasında invaziv işlem15chemoattractants hizmet molekülleri tanımlaması ve tümör içsel saldırganlık test izin. Genel olarak, 3D modeller daha yakından normal ve oncogenic doku morfogenez yansıtmak vitro hücre kültürü uygun fiyatlı bir çeşitlendirilmesi temsil eder.
Biz-si olmak ressam anılan modelleri7,10,11, temel 3D cep ortak kültür sistemi her iki insan ticari BrC hücre hatları bilinen agresif potansiyeli (luminal ve triple negatif türleri) ve ilköğretim kullanarak BrC hastalardan explanted hücreleri. Biz ilk geliştirilen bir model saldırgan olmayan (MCF-7) veya agresif (MDA-MB-231) BrC hücreleri U937 monosit bir hücre dışı matriks özü (ECME) ile işbirliği kültürlü neredeydin-tabanlı doğrudan hücre-hücre etkileşimleri izin 3D sistemi. Bu ortak kültürler nasıl etkiledi bu iki hücre soy arasındaki iletişimi genler kanseri saldırgan davranış ile ilgili bir dizi transkripsiyon belirlemek için kullanılmıştır. Bu bir artan üretim ürünlerinden birini, prostaglandin E2 (PGE2), iltihap kanser ilerleme rolü vurgulanacak bir bulgu olan çakıştı Siklooksijenaz-2 (COX-2) transkript önemli bir artış gözlenmiştir. MMP, artan transkripsiyon da bu agresif MDA-MB-231 hücre U937 monosit DQ-kollajen IV içeren kültürde ile birlikte kültürlü ne zaman daha fazla kolajen proteolizis ile korelasyon gözlendi. Belirtmek gerekirse eş kültürlerimiz hücre-hücre etkileşim mekanizmaları kollajen yıkımı için gerekli olan varsayım desteklememektedir. Daha doğrusu iki hücre soy arasındaki iletişimi tarafından salgılanan moleküller aracılı önerdi. Ayrıca, bu ortak kültür deneyleri hasat supernatants glandüler acini sigara dönüştürülmüş MCF-10A hücreleri13tarafından kurulan dağınık çözünür faktörler içeriyordu. Agresif bulundu ve salgılanan birincil BrC hücreleri monosit kemotaktik molekülleri MCP-1, GM-CSF ve RANTES düzeyde yüksek. Böylece, bir 3D kültür hücreleri hücre-hücre etkileşimleri önlemek için hücre kültür ekler ayrı kaldık sıraladı. Bu kültürler BrC hücreleri ve monosit arasında dolaylı iletişim adresine kullanılmıştır. Bu deneyleri, saldırgan olmayan ve agresif ticari BrC hücre hatları ve birincil BrC hücreleri ve üç çeşit insan monosit: ticari U937 ve THP-1 hücreleri ve birincil monosit (PMs) sağlıklı bağış (tüm periferik kandan izole monosit etkin olmayan bir durumda kullanılmıştır) kullanılmıştır. İnflamatuar sitokinlerin IL-1β ve Il-8 artan konsantrasyonları ortak kültür zenginleştirilmiş tespit edildi. Benzer şekilde, bu MMP-1, MMP-2 ve MMP-10 de BrC hücreleri-monosit ortak kültürler ve güçlendiren önceki bulgular14böylece arttı bulundu. Bu makale, birincil BrC hücreleri yalıtım ve 3D kültürlerde test noktası noktası iş akışı temsilcisi sonuçları ile birlikte sunulur. Bu eser belirli yönleri ile tümör biyolojisi sorgulamaya vitro 3D hücre sistemleri sağlar büyük potansiyeli iyi bir örnek teşkil eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitel hücreleri bir 3D kayma uyum içinde büyümek ve ECM proteinler ile onların etkileşim doku homeostazı için çok önemli. Monolayers (2D) yetiştirilen hücrelerde tabanlı birçok kanser çalışmaları ve onlar tümör oluşumu ve ilerleme birçok açıdan anlamak için kritik olmasına rağmen monolayers için hücrelerdeyse, ECM dayatır özellikleri özetlemek değil Örnek: sınırlayıcı yayılması, yapışma bağımlı hücre hayatta kalma, apikal demiri polarite, ECM remodeling, hücre farklılaşma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Proje No 233061 Ezequiel M. Fuentes-Pananá için ve Fondo de Apoyo a la Investigación, hastane Infantil de México Federico Gómez (proje numarası HIM-2014-053) tarafından desteklenmiştir. Espinoza-Sánchez NA Programa de Doctorado tr Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autonoma de México (UNAM) ve alınan bursu 231663 CONACYT gelen doktora öğrencisidir. E-S NA, da Meksika Enstitüsü sosyal güvenlik (IMSS) tarafından sağlanan mali destek kabul.
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
