Analisando a comunicação entre monócitos e células de câncer primário da mama em uma matriz Extracellular extrair (ECME)-sistema tridimensional baseado em
Summary
Aqui, descrevemos um método de cultura tridimensional para analisar a morfologia da mama primário de células de câncer, também como para estudar suas interações direta/indireta com os monócitos e os resultados tais como a degradação do colagénio, recrutamento de células imunes, célula invasão e promoção de inflamação relacionadas ao câncer.
Abstract
Incorporado na matriz extracelular (ECM), normais e neoplásicas de células epiteliais intimamente comunicar-se com células hematopoiéticas e não-hematopoiéticas, assim, extremamente influenciar o resultado de homeostase e doença do tecido normal. No câncer de mama, tumor-associado macrófagos (TAMs) desempenham um papel fundamental na progressão da doença, metástase e recorrência; Portanto, compreender os mecanismos da chemoattraction de monócitos para o microambiente do tumor e suas interações com as células do tumor é importante para controlar a doença. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um sistema tridimensional (3D) co-cultura de células de câncer (BrC) de mama humano e monócitos humanos. BrC células produzidas elevados níveis basais de regulamentado na ativação, normal de célula T expressa e secretada (RANTES), monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) e fator colônia-estimulando do Granulócito-macrófago (G-CSF), enquanto em co-cultura com monócitos, citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL) -1 beta (IL-1 β) e IL-8 foram enriquecidos em conjunto com a matriz metaloproteinases (MMP) -1, MMP-2 e MMP-10. Este microambiente de estroma do tumor promovido resistência à anoikis em MCF-10A 3D acinar estruturas, chemoattraction de monócitos e invasão de células de BrC agressivas. Os protocolos aqui apresentados fornecem uma alternativa acessível para estudar comunicação intra-tumor e são um exemplo do grande potencial em vitro celular 3D sistemas fornecem para interrogar a características específicas da biologia do tumor relacionados ao tumor agressão.
Introduction
Biologia do tumor é muito mais complexa do que se pensava. Montagem a evidência mostra que as células do tumor são mais do que uma mera massa de células de proliferação não controladas; pelo contrário, diferentes células neoplásicas parecem desempenhar funções diferentes, exibindo alta organização e hierarquia dentro do tumor1. Células tumorais são também em comunicação íntima com células não-transformadas: macrófagos, fibroblastos, linfócitos, adipócitos, células endoteliais, entre outras células estão todos imersos no andaime proteínas e polissacarídeos que constituem o ECM. Numerosas interacções directas e indirectas são estabelecidas entre as células transformadas e não transformadas e com o ECM, que exerce uma poderosa influência sobre o resultado de doença2,3. No caso específico da BrC, é particularmente importante dissecar a comunicação das células BrC com TAMs, Considerando que TAMs descobriu-se que desempenham um papel fundamental na evolução do tumor, aumentando o risco de metástase e de recorrência da doença4 ,5.
Para analisar interações intra-tumoral e seus possíveis resultados, novo 3D em vitro abordagens têm sido desenvolvidos com base na utilização de extratos de ECM que fornecem um microambiente muito mais complexo, mais perto da realidade da biologia do tumor, em comparação com o as culturas celulares convencionais monocamada em que as células crescem anexado ao plástico. Petersen e Bissell6 desde o primeiro modelo de benigno e células epiteliais mamárias malignas cultivadas em uma membrana basal de laminina-rico e foram os primeiros a descrever as estruturas de organotypic 3D que discriminem humanos benigno células epiteliais da mama de suas contrapartes malignas. Uma década mais tarde, o modelo desenvolvido dos Santos, Davi, e Brugge7,8,9 fornecido uma ferramenta valiosa para elucidar os caminhos biológicos comprometidos durante a transformação maligna dos ácinos glandulares, tais como formação de ácinos grande devido a proliferação descontrolada, a deslocalização das proteínas de junção apertada como prova da polarização celular prejudicada e perda de lúmen acinar, como resultado da resistência da célula de anoikis, um tipo de morte celular programada que ocorre em células dependentes de ancoragem quando eles desanexe o ECM circundante. Os modelos de Sarto, Jedeszko e Sloane centraram-se na atividade proteolítica de imagem por células, que está intimamente relacionada com a capacidade de invasão, outra característica crucial de tumor malignidade10,11,12. Estes modelos contam com matrizes de proteína misturadas com substratos diferentes proteínas fluorescência-extinto (DQ-gelatina, DQ-colágeno I e DQ-colagénio IV), em que sinais fluorescentes são indicativos da degradação proteolítica do colágeno. Modelos 3D também são usados para estudar as propriedades de células-tronco de ambos não-transformadas e células tumorais, em qual célula agregados, também denominado esferoides, podem ser cultivados em suspensão ou em ECM-como proteínas interrogando por mecanismos de diferenciação celular, assimétrica divisão celular, aderência de célula para célula e célula motilidade13,14. Ensaios de invasão permitam testes a agressividade intrínseca do tumor e a identificação das moléculas que servem como quimioatraentes durante o processo invasivo15. Em gerais, 3D modelos representam uma diversificação acessível em vitro cultura celular que refletem mais de perto a morfogênese de tecido normal e oncogênicos.
Desenhamos um sistema de co-cultura célula 3D baseado em modelos acima de7,10,11, usando as duas linhas de célula de BrC comerciais humanas de potencial agressivo conhecido (tipos luminal e triplo-negativo) e primário células explantadas de pacientes BrC. Nós primeiro desenvolveu um modelo onde não agressivos (MCF-7) ou agressivo (MDA-MB-231) BrC células foram co cultivadas com U937 monócitos em um extrato de matriz extracelular (ECME)-com base em sistema 3D que permitiu interações célula-célula direto. Essas culturas co foram usadas para determinar como a comunicação entre estas linhagens de dois célula influenciou a transcrição de um conjunto de genes relacionados ao comportamento agressivo de câncer. Observou-se um aumento significativo da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) transcrição que coincidiu com um aumento da produção de um dos seus produtos, a prostaglandina E2 (PGE2), que destacou o papel da inflamação na progressão do câncer. Aumento da transcrição de MMP também foi observado que correlacionados com maior proteólise de colágeno quando agressivas células MDA-MB-231 co foram cultivadas com U937 monócitos em culturas contendo DQ-colagénio IV. Digno de nota, as nossas culturas co não apoiar a suposição de que os mecanismos de interação célula-célula são necessárias para a degradação do colagénio. Prefiro sugeriu que a comunicação entre as linhagens de células de dois foi mediada por moléculas secretadas. Além disso, os sobrenadantes destes ensaios co-cultura colhidos continham fatores solúveis que desorganizado ácinos glandulares, formados por não-transformadas de células MCF-10A13. Foi encontrado que agressiva e células de BrC primárias secretadas níveis elevados de monócitos Quimiotáticos moléculas MCP-1, GM-CSF e RANTES. Assim, delineámos uma cultura 3D em que as células foram separadas em inserções de cultura celular para evitar interações célula-célula. Essas culturas foram usadas para abordar a comunicação indireta entre células BrC e monócitos. Para estes ensaios, não agressivo e agressivas comercial BrC linhas celulares e células primárias do BrC e três tipos diferentes de monócitos humanos: células U937 e THP-1 comerciais e monócitos primários (PMs) isolados do sangue periférico de doadores saudáveis (todos os monócitos foram usados em um estado não está ativado) foram utilizados. Observou-se aumento das concentrações de citocinas IL-1 β e IL-8 para ser enriquecido em co-cultura. Da mesma forma, verificou-se que a MMP-1, MMP-2 e MMP-10 também foram aumentados na BrC células-monócito co culturas e assim reforçando anteriores conclusões14. Neste manuscrito, um fluxo de trabalho do ponto-a-ponto de isolamento primário de células BrC e testes em culturas 3D é apresentado juntamente com resultados representativos. Este trabalho constitui um bom exemplo do grande potencial em vitro celular 3D sistemas fornecem para interrogar aspectos específicos da biologia do tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células epiteliais crescem em uma conformação espacial 3D e sua interação com as proteínas de ECM é essencial para a homeostase do tecido. Muitos estudos de câncer foram baseados em células cultivadas em monocamadas (2D), e embora eles têm sido fundamentais para a compreensão de muitos aspectos da formação de tumor e progressão, monocamadas não recapitular as características que o ECM impõe às células, para instância: limitar a proliferação, sobrevivência dependente de adesão celular, polaridad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo CONACyT FONSEC ISSSTE/SSA/IMSS projeto n. º 233061 para Ezequiel M. Fuentes-Pananá e pelo Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (número do projeto HIM-2014-053). Sánchez-Espinoza at é um estudante de doutorado do Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu bolsa 231663 do CONACYT. AT E-S, também reconhece o apoio financeiro fornecido pelo Instituto mexicano de Seguro Social (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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